CRISPR/Cas9基因组编辑技术研究沉香倍半萜合酶基因表达与调控

Agarwood is a defense response product of Aquilaria spp. or Gyrinops spp. plants after wounding. Agarwood sesquiterpene is the main active ingredient of agarwood and it is also a typical induced secondary metabolite of plants. Our research team has been constantly researching on elucidation the molecular mechanism of agarwood formation above ten years. Agarwood sesquiterpene synthase gene (ASS) is a key enzyme gene in the biosynthetic pathway. How the expression of ASS is induced is the key to understand the synthetic mechanism of agarwood sesquiterpenes. Our previous study found that ASS1 gene expression was regulated by some suppressors, and 18 genes annotated as sesquiterpene synthase genes, that are TPS-a family genes, were found in the genome of A. sinensis which was sequenced by our team recently. What the correlation between these genes and dozens of agarwood sesquiterpene components? How these genes are expressed and regulated in vivo? Is the suppressor regulation specific for ASS1? To solve these problems, in the present project, we proposed to use CRISPR/Cas9 genome editing technique to knockout TPS-a gene and suppressor gene, to replace the promoter of TPS-a gene with constitutively expressing 35S promoter, then to analyze the expression of genes and synthesis of sesquiterpene components. The research will be valuable to explain the molecular mechanism of agarwood formation.

沉香是沉香属或拟沉香属植物受到伤害后防御反应的产物，沉香倍半萜是沉香的主要活性成分，为典型的植物诱导型次生代谢产物。课题组十几年来不断推进沉香形成分子机制研究。沉香倍半萜合酶基因（ASS）是沉香倍半萜合成途径的关键酶基因，其表达的诱导启动原因是阐明倍半萜合成机制的关键。课题组前期研究发现ASS1基因的表达存在抑制子调控机制；并在已完成的白木香基因组中发现有18个注释为倍半萜合酶的基因，即TPS-a家族基因，这些基因的表达与沉香倍半萜组分多达几十种的关系如何？在白木香体内这些基因是如何表达调控的？抑制子调控机制是否是倍半萜合酶ASS1基因特有的？针对这些问题，本课题拟通过CRISPR/Cas9技术敲除TPS-a和抑制子基因，替换TPS-a基因启动子为组成型表达的35S启动子，分析基因表达与倍半萜组分的合成，为解析沉香形成的分子机制提供理论依据。

沉香是瑞香科沉香属（Aquilaria spp.）和拟沉香属（Gyrinops spp.）植物的树干或树根在受到各种伤害后引发自我防御反应的过程中，分泌特殊油脂等而形成。因其具有较高的经济价值，从理论上揭示沉香形成机制，可促进更有效的沉香生产技术的开发，从而推动沉香产业发展。沉香倍半萜是沉香的主要药效成分和芳香成分，也是沉香中生物合成研究较多的成分种类。沉香基因组中存在多个倍半萜合酶基因，其中极个别基因催化的底物和产物在体外，利用大肠杆菌表达纯化的酶，进行了功能分析。体内研究限制于白木香树木的遗传转化系统的缺失和不成熟。本研究立足课题组前期在沉香主要有效成分沉香倍半萜生物合成与调控研究成果基础上，开展利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究倍半萜合成酶基因功能的探索。通过项目实施，从34个沉香倍半萜合酶基因中筛选出初步判定6个基因可能与沉香快速高质量形成有关；建立了白木香毛状根诱导和遗传转化体系；利用组织培养技术建立了快速繁殖白木香遗传转化材料的方法；利用建立的毛状根遗传转化体系获得了组成型表达ASS1基因的白木香毛状根；建立了白木香的CRISPR/Cas9基因编辑技术体系，诱导获得了敲除白木香PDS和ASS1基因的毛状根。转化后的毛状根均生长缓慢，更详细的基因功能分析还有待毛状根的大量繁殖，但建立的遗传转化体系和CRISPR/Cas9基因编辑技术体系对于开展白木香基因功能研究有重要的应用价值。目前白木香基因组已见报道，具有了基因功能研究体系，将促进更多白木香基因生物功能的揭示和这些基因利用的开发。