苯并噻吩类含硫化合物单加氧酶的底物识别机制研究

燃油中含硫化合物的燃烧是造成环境污染的重要原因之一。采用生物脱硫工艺可以在较温和的条件下脱除传统加氢脱硫工艺难以脱除的大分子含硫化合物（苯并噻吩及其衍生物，BTs；二苯并噻吩及其衍生物，DBTs）中的有机硫。目前筛选到的菌株大都只能高效地脱除BTs或DBTs中的有机硫；现有的研究表明在苯并噻吩类含硫化合物的"4S"生物脱硫途径中，催化前两步反应的单加氧酶（BT单加氧酶或DBT单加氧酶）在菌株的底物识别过程中起着关键作用，但尚未见这两种单加氧酶类似蛋白结构及底物识别机制的相关报道。生物催化剂的底物识别范围和催化活性是决定生物脱硫工艺能否商业化应用的关键因素。本项目拟通过对这两种单加氧酶的结构解析、关键氨基酸的定点突变等研究内容阐明生物脱硫酶底物识别的分子机制，为生物脱硫菌株的遗传改良奠定基础，并期望在此基础上通过对单加氧酶的遗传改良拓宽菌株利用含硫化合物的底物范围。

微生物可以在较温和的条件下脱除燃油中含硫杂环化合物的有机硫，而不损失其热值。但目前所筛选到的菌株多数只能高效脱除二苯并噻吩（DBT）或苯并噻吩（BT）中的有机硫，很难两者兼顾。因此，阐明苯并噻吩类含硫化合物单加氧酶的底物识别机制对于利用基因工程手段拓宽其底物识别范围具有重要意义。本项目通过解析DBT单加氧酶及其与辅酶复合物的晶体结构确定了该酶的底物识别与催化活性中心；通过BT高效脱硫菌株Gordonia sp. C-6的比较转录组分析、基因组分析及体外酶活分析确定了菌株C-6中BT生物脱硫的代谢机制；并构建了能够同时识别并催化BT和DBT脱硫的基因工程菌株。具体成果如下：（1）成功获得了DBT单加氧酶（DszC）及DszC-FMN的晶体结构。发现DszC以四聚体的形式存在，其C端的无规则卷曲在维持蛋白的聚合形式和蛋白活性中起着重要作用。确定了由Tyr96、 Asn129、Phe161、 Ser163、Trp205、Ser215、Phe250、His391等氨基酸组成的活性中心，其中FMN、Tyr96、 Asn129和Phe250对于DBT在活性中心的正确定位起着关键作用。但在这些氨基酸的定点突变库中并未检测出能够识别并催化BT的突变。（2）鉴于关键氨基酸的定点突变并未使DszC获得识别并催化BT的能力，且尚未见到BT脱硫酶的报道。我们对Gordonia sp. C-6在以BT或Na2SO4为唯一硫源培养条件下的转录组进行了分析。与Na2SO4为硫源相比，在以BT为硫源时菌株C-6中表达水平上调的基因有135个。通过基因组分析，进一步发现有3个表达水平上调的基因构成了一个操纵子，它们的编码产物分别为苯磺酸盐水解酶、FMNH2依赖型单加氧酶和烷基磺酸盐单加氧酶。将该操纵子在E. coli Rosetta中表达后用全细胞破碎液作用BT，在其乙酸乙酯抽提物中检测到了剩余的BT和BT的脱硫产物邻羟基苯乙烯，从而确定了菌株C-6中BT的脱硫机制。（3）虽然BTs和DBTs有着相似的脱硫途径，但催化这两种化合物脱硫的酶之间进化关系较远，难以通过基因工程的办法拓宽其底物识别范围。为此，我们将BT脱硫酶基因在DBT脱硫菌株中进行了表达，从而构建了噻吩类含硫化合物高效脱硫基因工程菌。利用该工程菌可以同时脱除市售柴油中苯并噻吩、二苯并噻吩及它们衍生物中的有机硫，其脱硫率为97%以上。