从内质网应激信号通路研究加味阳和汤对骨性关节炎的早期作用机制

骨性关节炎（OA）的主要病理改变为关节软骨病损，关节软骨细胞增殖与凋亡失去平衡是骨性关节炎的主要发病机制之一，内质网应激信号途径是OA软骨细胞损伤早期反应的重要机制，对细胞功能的维持和存活起到重要的作用。UPR通路是细胞受到刺激，激活内质网应激反应后的一条重要的信号通路，UPR信号通路的激活可保护内质网，并促进受刺激的细胞的存活。中药对早期骨性关节炎疗效满意，但具体的作用机制不太清楚。本研究拟以改良Hulth法建立的KOA模型和体外培养的软骨细胞为研究对象，采用RT-PCR,Western blot，Real-time PCR及组织形态学等技术，研究加味阳和汤对内质网应激UPR通路变化规律的影响，揭示中药对骨性关节炎早期的作用机制。

本研究拟通过实验设计，研究其对软骨及软骨细胞中内质网应激信号通路变化规律的影响，揭示中药对骨性关节炎早期的作用机制。.方法:1．动物实验：将新西兰兔随机分为三组，除正常组外，改良的Hulth造模方法造成膝骨性关节炎模型，治疗组给予加味阳和汤灌胃，模型组组给予生理盐水灌胃。观察一下指标：分别于4、6、8周拍摄x线，制作光镜、电镜切片，TUNEL检测软骨组织细胞凋亡情况，免疫组化法检测Coll II蛋白表达情况，Realtime PCR软骨组织中GRP78、XBP1等基因表达情况。2．离体实验 实验分组：行大鼠软骨细胞原代培养，随机四组：正常组：用10%正常兔血清的培养液。TG组：用含10%正常兔血清，加入1uM的TG，中药组：用10%加味阳和汤含药血清的培养，中药+TG组：用含10%正常兔血清培养液，加入1uM的TG，共培养24h。CCK-8法检测软骨细胞增殖情况，采用免疫荧光、westernblot、Realtime PCR 检测相关基因蛋白表达的影响。 .结果：1．动物实验：（1）加味阳和汤能够减轻软组织的退变，延缓骨赘的生成，保护细胞内重要细胞器的结构，以及延缓细胞外基质及胶原纤维的退变、紊乱，明显延缓骨性关节炎的进展。（2）在新西兰兔骨性关节炎4、6、8周后，GRP78、XBP1的表达量较治疗组明显增高，然而II型胶原减少，加味阳和汤能够减缓BIP、XBP1的增高趋势，增加II胶原的表达。2．离体实验（1）不同浓度的加味阳和汤含药血清均能促进软骨细胞的增殖，其中15%的增值最快（P<0.01）。（2）Western Blotting、免疫荧光结果、Realtime PCR提示：软骨细胞在经过TG刺激诱发内质网应激后p-eIF2α、GRP78、p-PERK、ATF4等表达量TG最高、中药+TG组次之、正常组及TG组少量表达量。II型胶原的表达量相反。.结论：骨性关节炎4、6、8周时，内质网应激被激活，内质网应激的重要因子BIP、ATF4、XBP-1等表达量增高，II胶原表达含量降低，加味阳和汤能够延缓软骨组织的退变，保护软骨的功能及结构，增加II型胶原的表达量，缓解内质网应激部分因子表达异常。加味阳和汤能够较少TG刺激诱发内质网应激p-eIF2α、GRP78、p-PERK、ATF4表达量，缓解内质网过度应激对软骨细胞产生进一步损害。