基于C-末端肽的蛋白质组分离鉴定新方法研究

Bottom-up策略在目前蛋白质组分离鉴定中应用最为广泛。然而，该策略将数万个蛋白质酶解成数十万、甚至数百万条肽段后进行分离鉴定，不仅对色谱分离提出很高的挑战，而且也会影响质谱鉴定的准确性。因此，发展针对特征性肽段的分离鉴定新方法对于提高蛋白质组的分离鉴定能力具有重要意义。蛋白质C末端区域序列具有很高的特异性，能够在一定程度上代表蛋白质。本项目拟开展基于C-末端肽的蛋白质分离鉴定方法研究。使用阳离子交换色谱分离与脱水胰蛋白酶吸附相结合的方法，对C-末端肽进行选择性富集；使用质谱信号增强试剂对不含有碱性氨基酸的C-末端肽进行衍生，提高质谱检测灵敏度；优化多维液相色谱分离平台，对C-末端肽进行高效分离和质谱鉴定。上述针对C-末端肽的选择性富集、高效分离和高灵敏度检测的新方法，有望弥补目前蛋白质组分析策略的不足，显著提高蛋白质组分离鉴定的能力。

经过三年的研究，取得了以下成果：发展了基于位点选择性标记和亲和去除的蛋白质C末端肽富集方法，对于多肽alpha氨基的标记选择性和效率分别达到97%和92%，对于多肽epsilon氨基的标记效率达到95%；以复杂蛋白质样品（大肠杆菌和酵母蛋白）对发展的C-末端肽富集方法进行考察，与富集前相比，对C-末端肽的选择性从10%提高到接近70%，鉴定数目提高了一倍，其中对于大肠杆菌的蛋白质C末端肽鉴定数目比文献报道提高了4倍；通过对色谱分离条件进行优化，发展了基于SCX-RPLC的二维液相色谱方法，实现了对蛋白质组C末端的高效分离；合成了衍生化试剂溴化1-丁基,3-(3-氨丙基)咪唑，通过对标准多肽C端羧基进行标记，多肽的质谱响应信号与未标记前相比提高了约40倍，与商品化的的哌嗪试剂衍生效果相比，具有更显著的离子化效率增强能力；将发展的蛋白质组C 末端肽富集和分离方法应用于小鼠肝癌高低转移细胞株蛋白质C末端差异分析，发现29个差异蛋白，其中10余个蛋白被文献报道与癌症或者细胞移动相关；发表SCI论文二篇，已投稿论文两篇，申请发明专利一项，培养研究生二名。