小类泛素修饰因子的靶标蛋白质及修饰位点的规模化分析新方法

Small Ubiquitin-like Modifier(SUMO) plays important roles in regulating many physiological activities of cells. Accurate identification and quantification of the SUMO substrates and modification sites at proteome scale is helpful for studying the molecular mechanisms of SUMO modification and its influence on the functions of protein substrates. However, there is no method for the selective enrichment and efficient and accurate identification of wild-type SUMO modified peptides in any kinds of protein samples. The aim of the project is to synthesize labeling reagents for peptides that can significantly change the chromatographic retention time of peptides, establish diagonal chromatographic method for the highly selective enrichment of SUMO modified peptides; Synthesize standard SUMO modified peptides library, develop high efficient and accurate algorithms for the identification of SUMO modified peptides in proteome samples by investigating their fragmentation patterns in mass spectrometer; establish high accurate quantification method based on all ions monitoring and fragment ion intensities in MS/MS spectra for SUMO modified peptides; apply the developed novel method for proteome-scale analysis of SUMO modified proteins and modification sites to the analysis of SUMO substrates and their modification sites in fission yeast and provides important technical support for disclosing the regulation networks of SUMO modification and studying the functions of SUMO modification in biological processes.

小类泛素修饰因子（Small Ubiquitin-like Modifier，SUMO）在诸多细胞生理活动中发挥重要调节作用。在蛋白质组水平精确鉴定和定量SUMO的靶标蛋白质及其修饰位点对研究修饰发生的分子机制具有重要意义。目前缺乏对各种蛋白质样品中野生型SUMO修饰多肽进行选择性富集和高效高准确度鉴定的方法。本项目拟合成能够显著改变色谱保留的多肽标记试剂，进而基于对角线色谱方法发展高选择性的蛋白质组SUMO修饰肽段富集方法；合成SUMO修饰标准肽段库，对其质谱碎裂模式进行分析，建立高效和高准确度的SUMO修饰肽段鉴定算法；发展基于全离子监测和质谱碎片离子强度的SUMO修饰肽段高准确度定量方法；将建立的SUMO修饰蛋白质及位点的规模化分析方法应用于裂殖酵母中被SUMO修饰的底物蛋白和修饰位点的分析,为揭示SUMO蛋白的修饰调节网络和探索这些蛋白修饰在生物学过程中的作用提供重要的技术支撑。

小泛素相关修饰物（SUMO）是重要的蛋白质翻译后修饰,在细胞内具有多种生物学功能。本项目针对SUMO修饰富集和鉴定中存在的问题，发展了多种新型的蛋白质组SUMO修饰富集、鉴定及定量策略。.为了研究SUMO修饰肽段的质谱碎裂规律，我们合成了SUMO C末端连着底物肽段的标准多肽库，获得了SUMO修饰肽段质谱数据集，结合人工读谱和筛选，构造了高质量标注数据集，系统地对SUMO修饰肽段鉴定算法进行优化。.发展了基于蛋白标签的 Pmt3（裂殖酵母中SUMO同源蛋白）修饰的鉴定方法，使用His 和AVI两个标签进行了两步富集，确定了数百个Pmt3修饰位点，与文献相比，有184个相同的修饰位点和193个相同的蛋白质。 .为了提高SUMO修饰肽段的富集选择性和鉴定效率，根据Pmt3 C端的肽段序列，结合酶切位点设计了分支状的抗原肽段，获得多克隆抗体血清。使用酵母样品中的Pmt3修饰的肽段检测血清抗体的富集效果，与富集前相比，Pmt3 C端肽段相关的肽段谱图数目由890提高到4398。.利用SUMO肽段残基携带的酸性氨基酸（D/E)较多的特点，发展了基于强阴离子交换色谱（SAX)的上的SUMO肽段富集方法，与富集前相比，鉴定到的SUMO1修饰肽段谱图数目由2条提高到107条，SUMO2/3修饰肽段谱图数目由0条提高到38条。将其应用于人源细胞HeLa样品中内源型SUMO化肽段的富集，共鉴定到206条SUMO1修饰肽段，92条SUMO2修饰肽段。. .进一步发展了阴离子交换色谱（SAX）与去SUMO化酶结合的内源型SUMO化肽段的富集方法和蛋白质组学定量分析策略，应用于干扰素IFNγ诱导细胞产生抗病毒/肿瘤活性过程SUMO化作用的底物蛋白及其位点研究，鉴定到了234个具有高可信度的SUMO化位点，其中43个位点在干扰素IFNγ与A549细胞共孵育过程中发生了上调，9个位点发生了下调。在上调的位点中我们找到了PML，SP100，STAT1等参与了IFN诱导细胞抗病毒的信号通路过程及PML-NB的形成过程的SUMO化蛋白及其位点信息。同时其余的发生了上调的SUMO化作用底物蛋白也是参与该通路的潜在作用靶点。