基于凝胶电泳分离和末端肽富集的蛋白质水解分析方法研究

Proteolysis is not only a catabolic process for metabolite recycling and energy generation, but also a key regulatory post-translational modification in a series of essential cellular processes, including cell proliferation and apoptosis, development and differentiation, signal transduction. To circumvent the low coverage of proteolysis analysis in complex system, the project intends to develop new technologies based on gel electrophoresis separation and proteolysis product enrichment: 1) Dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis based on GELFREE (Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis) system which exhibits high sample capacity and recovery will be utilized to reduce the loss of low abundant protein and make it compatible with the subsequent enrichment process; 2) N-termini positive selection which is capable of enriching proteolysis product will be performed to improve the identification of low abundant proteolysis product and determine the site of proteolytic cleavage. By integrating the above technologies, we will establish a universal, deep-coverage, high-confidence, and full-information approach for proteolysis analysis, which will provide important technical support for the analysis of proteolysis-related biological process and functional annotation of protease.

蛋白质水解不仅是代谢循环和能量生成的必要过程，而且是一种重要的翻译后修饰，在细胞增殖和凋亡、发育和分化、信号传导等生命过程中发挥了举足轻重的作用。针对目前复杂体系中蛋白质水解鉴定覆盖度低的问题，本项目拟以凝胶电泳分离和水解产物富集为切入点：1）发展基于GELFREE（凝胶洗脱液相组分截留）系统的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，实现分离产物的高效回收并提高分离产物的样品分析量，减少低丰度蛋白质的损失，并与后续的富集过程良好地兼容；2）发展N末端肽正向富集方法，实现蛋白质水解产物的富集，提高低丰度水解产物的鉴定效率，并获取水解位点信息。通过上述技术的集成，建立具有普适性、高覆盖、高可信、信息全面的蛋白质水解分析方法，为推动蛋白质水解相关生物过程的研究以及蛋白酶的功能注释提供重要技术支撑。

蛋白质末端的研究不仅对于蛋白质的结构和功能注释十分必要，还能够为蛋白酶作用机理的揭示提供重要信息。针对传统N末端富集方法中丢失小分子量蛋白质和碎片蛋白的不足，发展了基于可逆键合材料的蛋白质N末端肽正向富集方法，用于蛋白质N末端的简单快速富集，实现了N末端肽的高选择性富集（>99%）；进一步发展了基于二硫吡啶标记的正向富集方法，用于HeLa蛋白质N末端组分析，蛋白质N末端肽和neo-N末端肽的鉴定数目分别提高了3.9和0.6倍；3）针对传统蛋白质组N末端肽反向富集需要采用大量去除材料导致N末端肽回收率低，以及步骤繁琐、样品损失等问题，发展了基于二辛基标记的蛋白质组N末端肽反向富集方法。用于酵母蛋白质N末端组的分析，蛋白质N末端肽和neo-N末端肽的鉴定数目分别提高了2.1和3.3倍。结合多种酶切方式，鉴定数目进一步提高50%和90%；4）实现了HeLa细胞胞内及分泌蛋白N末端甲硫氨酸剪切、信号肽剪切、候选翻译起始位点、蛋白质水解相关的基因蛋白组注释。对细胞凋亡相关的caspase蛋白酶的作用底物和位点进行分析，发现了53个尚未报道的高可信底物。