DDAH2启动子DNA甲基化对内皮祖细胞功能的影响及其在动脉粥样硬化发生中的作用

二甲基精氨酸二甲胺水解酶2 （DDAH2）是一种胞浆蛋白酶，在调节内皮细胞功能中起关键作用。近来发现，内皮祖细胞（EPCs）也表达DDAH2；DDAH2在调节EPCs功能中起重要作用，其表达改变与动脉粥样硬化（AS）的发生发展密切相关。研究发现DNA甲基化是滋养层干细胞分化过程中调节DDAH2表达的重要方式，而我们前期实验结果亦显示AS危险因子同型半胱氨酸可引起DDAH2的表达水平及DNA甲基化状态改变。以上研究提示DNA甲基化可能参与调控AS发病过程中DDAH2基因表达。本研究将首先观察AS病人与健康对照外周血EPCs中DDAH2的启动子甲基化水平；在此基础上，初步探讨DDAH2启动子甲基化水平在调节EPCs功能中的作用，并进一步研究调节DDAH2启动子甲基化水平的机制及在AS发生中的作用。本项目将有助于阐明DNA甲基化调节EPCs功能的机制，为临床治疗AS提供新思路。

内皮功能受损是动脉粥样硬化（AS）发生发展的病理基础，内皮祖细胞（EPCs ）在内皮修复和血管新生中发挥重要作用。二甲基精氨酸二甲胺水解酶2 （DDAH2）是一种胞浆蛋白酶，在调节内皮细胞功能中起关键作用。研究发现，EPCs也表达DDAH2，并与EPCs功能密切相关。然而， DDAH2表达的分子机制尚不清楚。本项目旨在探讨DDAH2启动子DNA甲基化水平与DDAH2基因表达及 EPCs功能的关系，证实异常DNA甲基化修饰在EPCs功能缺陷及AS发生中起重要作用。本项目发现AS危险因子同型半胱氨酸（Hcy）可诱导人脐静脉内皮细胞凋亡并可呈剂量依赖性（0.3 to 3.0 mM）抑制DDAH2 mRNA表达，同时伴有DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达水平的上调及DDAH2基因的启动子区域高甲基化。DNA甲基化抑制剂5-Aza可抑制Hcy的上述作用。此外，我们利用体外甲基化方法进一步验证DDAH2基因启动子活性是否受DNA甲基化调控，结果显示DNA高甲基化可显著抑制DDAH2基因启动子活性，暗示DDAH2是一个DNA甲基化敏感基因。为了进一步探讨DDAH2启动子甲基化与EPCs功能的关系，我们用密度梯度离心分离了25例冠状动脉造影阳性患者和15例冠脉造影正常的健康患者外周血单个核细胞，并诱导其分化成EPCs。结果表明，冠心病患者EPCs的粘附功能显著下降，伴有DDAH2 mRNA表达水平下调。冠心病患者EPCs中DDAH2启动子呈高甲基化状态，与EPCs粘附功能呈显著负相关。为进一步阐明DDAH2甲基化对EPCs功能的调节机制，我们用Hcy（0.3，1.0，3.0mM）孵育EPCs 48h，结果表明Hcy能显著抑制EPCs粘附功能，伴有DDAH2 mRNA表达显著下调及DDAH2启动子甲基化水平升高，而Hcy的上述作用能够被5-Aza抑制。以上结果表明，Hcy可通过上调DDAH2启动子甲基化水平，导致内皮细胞及EPCs功能缺陷，并初步阐明DDAH2启动子异常DNA甲基化修饰在内皮细胞及EPCs功能缺陷起重要作用。本项目首次从临床病人及细胞水平探讨了DDAH2启动子甲基化水平对内皮细胞及EPCs功能的调节，为揭示AS发生的表观遗传学机制奠定了基础。此外，鉴于DNA甲基化修饰的可逆性，逆转DDAH2启动子高甲基化修饰状态可能为治疗AS提供新的靶点和思路。