食品中副溶血性弧菌快速富集与检测技术研究

In recent years, foodborne disease caused by pathogenic microbial has become one of the main problems affecting the food safety. It is necessary to strengthen the monitoring, rapid and accurate detection technologies of its ralated pathogens. This topic is to design a specific fusion protein antigen of Vibrio parahaemolyticus by the specific fusion protein technology, combined with immunomagnetic separation technique and RIDA technology, and to realize the rapid enrichment and accurate detection of pathogen bacteria in tested samples. This topic research contents include:① preparation and characterization of surface-functionaled magnetic nanoparticles; ② preparation and characterization of pathogen bacteria specific antigen fusion protein and its yolk antibody（IgY）; ③ establishment of immunomagnetic separation methods of pathogens and the treatment of the tested samples; ④ design and synthesis of single stranded DNA report probe and deal with the samples; ⑤rapid detection of the pathogen bacteria in tested samples by using fluorescence spectrophotometer. The purpose of this research is to design and prepare a detection kit of with our own intellectual property and broad application prospect, which can be used to detect Vibrio parahaemolyticus rapidly and accurately.

近年来，由病原微生物引起的食源性疾病已成为影响食品安全的主要问题之一，加强对其监控及快速、准确的检测技术研究十分必要。本课题利用融合蛋白技术设计合成副溶血性弧菌的特异融合蛋白抗原，联合免疫磁珠分离技术和核酸快速等温检测放大技术，实现对待检样品中病原菌的快速富集与准确检测。课题的主要研究内容包括：①表面功能化磁性粒子的制备及表征；②病原菌特异融合蛋白抗原及其鸡卵黄抗体IgY的制备及鉴定；③病原菌免疫磁珠分离方法的建立及待检样本的处理；④DNA报告探针的设计合成及其与介质的偶联；⑤借助荧光分光光度计对待检样品进行快速检测。课题研究的目的是设计制备具有我国自主知识产权和广泛应用前景的副溶血性弧菌检测试剂盒，借助荧光分光光度计实现对副溶血性弧菌快速、准确检测。

近年来，由副溶血性弧菌引起的食源性疾病比例呈逐年上升的趋势，其已成为影响食品安全的主要问题之一，加强对食品中副溶血性弧菌的监控及快速、准确的检测技术研究，对于预防其引起的食源性疾病的发生，保护人群健康具有重要意义。本课题利用卵黄抗体技术制备能够识别副溶血性弧菌卵黄抗体，并将其与羧基磁珠偶联制备免疫磁探针，利用免疫磁分离技术实现对待测样品中目标病原菌的快速富集与分离，联合核酸等温扩增检测技术实现对目标病原菌的快速、准确的检测。. 经过三年的研究，课题研究工作已完成，并取得预期的研究成果。课题总体研究工作简介如下：(1) 完成了表面功能化磁性纳米粒子的制备及表征工作，获得了磁性优良、形状规则、粒径均一，且表面含有羧基的磁性纳米粒子。(2) 利用融合蛋白技术设计合成了副溶血性弧菌特异抗原融合蛋白，同时利用卵黄抗体制备技术完成目标病原菌特异性鸡卵黄抗体IgY 的制备及鉴定。结果表明制备的IgY抗体效价为1:128000，蛋白含量达到7.318 mg·mL-1，特异性和纯度较好。(3) 采用EDC和NHS作为偶联剂，将羧基磁珠与所制备的卵黄抗体进行偶联制备可识别目标病原菌的免疫磁珠，通过红外光谱、Zeta电位等方法进行表征，结果显示卵黄抗体被成功偶联于羧基磁珠表面。为使免疫磁珠能够较好的富集目标菌，获得最佳的捕获效果，对免疫磁珠用量和富集时间进行了优化，确定了最佳的磁珠用量为100 μL，富集时间为60 min 。（4）利用基因组DNA取试剂盒提取副溶血性弧菌染色体DNA，作为待检样本。(5) 以副溶血弧菌基因tlh 中的一段保守区域为目标序列，设计合成所需引物。同时选取荧光染料HNB与SYBR Green I 作为核酸等温扩增检测的荧光染料，并优化检测探针中HNB用量。 (6) 采用所制备的免疫磁珠对待检样品中的目标菌进行富集和分离，并提取样本DNA，然后利用核酸等温扩增检测技术，对目标病原菌进行检测。结果显示，该方法的检出限为104CFU/mL，重复性和特异性较好，并且该检测方法优于商品化的试剂盒和PCR检测，并可用于实际样品的检测。该检测方法具有较好的准确度和特异性，有望应用于疾病预防控制中心和进出口检验检疫等部门，能够产生较大的经济效益和社会效益。(7) 研究成果已在国内、外期刊发表论文9篇；申请发明专利3项；培养3名硕士研究生和2名本科生。