SWEETs家族基因在番茄果实糖转运与积累过程中的功能分析

SWEETs proteins are a newly identified class of sugar transporters that facilitate diffusion of sugars across cell membranes down a concentration gradient. Manipulating SWEETs expression is fundamental to crop yield formation by proper control of carbohydrate partitioning and transport. At present some members and the physioligical function of SWEETs have been identified in plant leaves and flowers organs. However, SWEETs is little reported in fruit organs as an important "Sink" in sucrose metabolism and the accumulation of physiological function and regulation mechanism. In this study, the members of tomato SWEETs will be cloned and heterologously expressed in yeast (Saccharomyces cerevisae) strain SUSY7/ura3 for sucrose uptake activity research. The pattern of expression of the SWEETs in various tissues will be assessed quantitatively by performing real-time PCR with the sucrose-accumulation trait of the wild species tomato (L. chmeilewskii) and the hexose accumulation trait of the domesticated tomato (Lycopersicon esculentum cv. Micro-Tom). Then the SWEETs is further tested key amino acid residues responsible to the transporter-sugar interactions using the heterologous split-ubiquitin system and characterized celluar localization and functional regulation. Activity of sucrose transport and sugar accumulation during tomato fruit development will be analyzed by the uptake rate of 14C-labeled sucrose with over-expression of SWEETs and silencing of its expression in tomato fruit. This study will provide a novel in sights and genetic improvement into the improve fruit performance and yield development by regulation of SWEETs.

SWEETs是高等植物中一类全新的介导糖转运的易化扩散蛋白家族，对调控作物产量形成中碳素转运与分配具有重要作用，目前已在植物的叶片、花器官鉴定了部分成员的生理功能，而作为重要"库"组织的果实器官中介导蔗糖供给与代谢积累的生理功能和调控机理尚无报道。本研究在已克隆番茄SWEETs基因家族成员的基础上，通过酵母缺陷型的异源表达体外验证SWEETs蔗糖转运活性；通过实时定量PCR分析获得果实特异的蔗糖转运蛋白基因SWEETs，并进一步利用分裂泛素化酵母双杂交技术探讨SWEETs蛋白之间的互作关系；另一方面进行过表达及RNAi转基因分析，探讨SWEETs在番茄果实成熟过程中调控蔗糖转运与积累的分子机理，为栽培番茄果实产量和品质的遗传改良提供理论依据及新思路。

SWEETs是高等植物中一类全新的介导糖转运的易化扩散蛋白家族，对调控作物产量形成中碳素转运与分配具有重要意义，目前仅在植物的叶片、花器官鉴定了部分成员的生理功能，而作为重要“库”组织的果实器官中介导蔗糖供给与代谢积累的生理功能和调控机理尚无报道。本项目以番茄基因组数据为基础，利用生物信息学方法首次在重要蔬菜作物-番茄中鉴定了SWEETs基因家族成员，序列比对发现番茄SWEETs基因家族成员都具有典型的7次跨膜α-螺旋的糖运输蛋白, 它们由2个重复的具有3次跨膜α-螺旋的 MtN3 基序和一个起连接作用的跨膜α-螺旋组成的2个MtN3/PQ-loop跨膜结构域组成；利用分裂泛素化酵母双杂交技术及双分子荧光技术首次在番茄果实中明确了SWEET基因家族成员可通过形成同源或异源多聚化结构而发挥功能，说明具有单个 7跨膜MtN3结构域的分子并不足以在疏水性的质膜上形成一个亲水的通道让葡萄糖等分子通过，这也为揭示小分子载体蛋白在行使功能时普遍具有多聚化现象及高等植物关于MtN3结构域具有自身多聚化形成有功能的结构提供了有力的实验佐证。同时通过实时定量PCR分析获得果实特异的蔗糖转运蛋白基因SWEETs，利用酵母己糖缺陷型突变体验证了番茄果实中差异表达的4个SlSWEET蛋白均具有转运葡萄糖和果糖的特性。另一方面进行过表达及RNAi转基因分析，探讨SWEETs在番茄果实成熟过程中调控蔗糖转运的分子机理以及蔗糖积累与糖转化蛋白活性的关系，获得4个SWEETs基因沉默及过表达的T1代株系。明确了SWEET活性改变后，定位于质膜的果实4个SWEET基因介导的糖易化扩散活性会受到影响，引起果实中果糖和葡萄糖的含量增加加倍，而蔗糖影响不大。这说明植物中的SWEET基因功能存在冗余，沉默SWEET基因后会引起分支其他成员及糖代谢相关酶基因活性改变，进而保持稳定的蔗糖水平，而果实单糖水平的提高对果实品质及产量的形成起了重要作用。以上结果为利用基因编辑手段改变SWEET活性来提高番茄品质，形成高糖番茄提供了新思路。