与苹果果实果糖积累相关的2个己糖转运蛋白的功能分析

果实甜度主要取决于糖在液泡中的积累量，果糖（Fru）作为苹果果实中主要的糖之一，在液泡中积累需要有特异己糖转运蛋白（HT）的作用。研究发现，在苹果20多个HT中，HT4和HT9表达与果实Fru积累存在明显的相关性。为探明苹果HT4和HT9与Fru积累的关系，本项目预通过亚细胞定位、定量PCR、免疫原位杂交技术研究二者组织细胞的表达特性；分别在酵母中异源表达，研究它们对Fru等己糖的转运能力及特性；在苹果果肉愈伤组织中分别过量表达或干扰，研究二者表达量改变对果肉细胞Fru等糖含量及吸收能力的影响；在拟南芥中过量表达，研究过量表达对拟南芥生长发育及糖代谢和抗逆性的影响；最后分析不同苹果品种间HT4和HT9表达量与甜度、Fru等糖含量的关系。以探明这两个特异己糖转运蛋白表达与Fru积累相关基因的功能及其与果实糖积累的关系，为认识果实中Fru等糖积累的转运机制和甜度品质改良与育种奠定理论基础。

为探明苹果HT4和HT9与果实糖积累的关系，项目组按照研究计划和实施细则，首先通过拟南芥原生质体和苹果果肉细胞的免疫原位杂交技术分析了苹果HT4和HT9的亚细胞定位，发现HT4定位于液泡膜，HT9定位与质膜，且二者转录和翻译水平上的表达均与果实中Suc和Fru的积累正相关。在酵母缺失体EBY.VW-4000中异源表达发现，HT4主要转运Glc，而HT9对Glc和 Fru均有转运活性，且对Fru的转运活性高于Glc。在苹果果肉愈伤组织中，对HT4和HT9分别进行了过量表达，获得了转化系，糖含量分析发现HT4的过量表达降低了愈伤组织Glc的含量，增加了Suc和Fru含量，同时提高了愈伤组织在Glc培养基上的生长速率，抑制了其在Suc和Fru培养基上的生长速率， 而HT9过量表达增加了苹果果肉愈伤组织中Fru、Glc和Suc含量，对生长无明显影响。模式植物拟南芥中的过量表达也发现，HT4过量表达能促进生长，降低Glc含量，增加Fru和Suc含量，而HT9过量表达均能增加Glc和Fru的含量，但降低了对盐胁迫、干旱的抗性。为分析二者过量表达对果实糖含量的影响，将其而番茄中过量表达，发现通过分子鉴定的HT9过量表达抑制了番茄的生长，使番茄表现出矮化性状，增加了果实中Fru和Glc含量，而HT4过量表达株系初步发现生长明显增加。这些结果表明，定位于液泡膜的HT4通过将Glc从液泡内运出，降低液泡渗透势，进而促进了Fru和Suc在液泡中的积累，而定位于质膜的HT9可能主要是参与了苹果Suc的质外体卸载和果实成熟过程中胞外Fru和Glc的回捡。同时，为了进一步了解苹果基因组中糖转运蛋白家族与糖积累的关系，利用RNA-seq技术分析了苹果果实发育过程中糖转运蛋白家族的表达模式，构建了苹果果实中相关转运蛋白与糖积累关系的模型，发现苹果果实中Fru和Suc高度积累是TMT和EDR6（HT4）家族共同作用的结果，即TMT可能负责Fru、Suc和Glc向液泡内的转运，而EDR6负责Glc的向外转运，这种模式有利于苹果果实中Fru和Suc的大量积累。通过本项目的研究，已发表相关论文3篇，其中SCI论文2篇，已完成初稿文章2篇。同时本项目的研究为进一步探明苹果糖积累机制奠定了材料和方法基础。