青枯菌Po82菌株特异性III型效应子鉴定及其功能研究

Bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is a devastating disease in warm and humid regions worldwide. Ralstonia solanacearum strain Po82, belonging to phylotype IIB/sequevar 4 (historically known as race 2), was found to be pathogenic to both solanaceous plants and banana.In this study, in order to identify novel type III effector proteins in Ralstonia solanacearum and elucidate the molecular mechanism of pathogenicity variation of Po82 strain, three Po82 strain-specific genes are selected as candidate effector genes on the basis of bioinformatics analysis.The candidate genes were characterized by mutagenesis, translocation test and subcellular location analysis. In brief, the mutants of candidate genes were constructed by using homologous recombination. Based on the mutant strain, the complement strains were constructed. The pathogenicity and the biological function of wild type, mutant strains and the complement strains were tested. Western blotting and Adenylate cyclase (CyaA) translocation assay were employed to investigate the transloction of candidate gene products via the hrp type III scretion system. To determine subcellular location of candidate effectors ,Agrobacterium-mediated transient gene expression in mesophyll cells of tobacco leaf was used.

植物细菌性青枯病（Bacterial wilt of plants），是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al.，简称青枯菌）引起的一种世界性重大病害。我们前期研究首次发现并报道了兼具青枯菌2号和3号小种致病力的特殊菌株-Po82。本研究在该菌株全基因组序列测定及比较基因组学分析的基础上，拟以Po82菌株3个特有的候选III型效应子为研究切入点，采用同源重组双交换法，构建候选基因的缺失突变株，通过功能互补分析基因功能；利用western blotting、腺苷酸环化酶转运以及GFP亚细胞定位手段验证候选基因产物是否通过III分泌系统转运分泌。以期发掘新的青枯菌III型效应子，初步解析Po82菌株致病力分化分子机理，为进一步揭示青枯菌寄主适应性进化提供科学依据。

植物细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al.，简称青枯菌）引起的一种世界性重大病害。青枯菌在与其寄主长期协同进化的过程中，表现出广泛的生态和寄主适应性，演化出明显的致病力表型分化特征。本研究以青枯菌致病力分化菌株Po82为研究对象，旨在发掘新的III型效应子，为进一步深入探究青枯菌的致病与寄主适应性进化机理提供理论依据。.本研究采用反向遗传学策略，以生物信息学分析遴选获得的Po82菌株特有候选III型效应子编码基因hopAF1、c00283和m00778为研究对象，构建了候选基因的缺失突变菌株及其相应互补菌株，并通过PCR扩增及DNA测序进行了筛选验证。.致病生物学的测定结果显示：候选基因hopAF1、c00283和m00778的缺失造成突变菌株的致病力较野生型菌株显著下降，病情指数分别降低了25.1 %、15.8%和19.4%。相应的互补菌株可恢复突变株毒力。基础生物学研究结果证实，hopAF1、c00283和m00778基因的缺失对Po82菌株的生长速率、运动性和生物膜形成能力没有影响；然而，hopAF1、c00283和m00778基因的缺失造成Po82菌株于番茄茎部的定殖能力显著下降。.半定量RT-PCR结果显示，候选基因hopAF1、c00283和m00778在富营养和寡营养hrp诱导培养条件下的表达趋势与III型分泌系统调控基因hrpB与III型效应子PopB编码基因一致。腺苷酸环化酶转导实验的研究结果证实，hopAF1基因的编码产物可以通过Po82菌株的III型分泌系统转运泌出至寄主植物细胞内。因此证实了HopAF1是此前在青枯菌中未曾报道过的新的III型效应子。.为进一步深入探究青枯菌Po82菌株特有III型效应子HopAF1与寄主适应性进化的关系，以寄主范围迥异的青枯菌5个小种的代表菌株为受体菌株，成功构建了携带hopAF1基因高效表达载体的重组菌株。致病性生测结果表明：hopAF1基因的高效重组表达载体可赋予青枯菌1号小种菌株GMI1000、4号小种菌株Aq侵染本生烟的能力，赋予了单一寄主桑青枯病5号小种菌株M7侵染番茄、本生烟以及香蕉的能力。此前在寄主适应性进化相关研究领域，尚未见青枯菌藉单一III型效应子的获取而扩大寄主范围的报道。