植物青枯菌VI型分泌系统核心组成基因的鉴定和分析

VI型分泌系统（type VI secretion，T6SS）是2006年细菌中新发现的蛋白泌出系统，广泛存在于病原细菌和共生菌中。分析植物青枯菌基因组序列，发现在大质粒上存在T6SS基因簇。采用生物信息学方法分析存在T6SS的细菌基因组，在植物青枯菌基因组T6SS基因簇中确定了8个核心组成基因，用标记置换法构建T6SS基因突变体，通过功能互补分析T6SS基因的功能。单向、双向蛋白电泳分析T6SS基因突变体和野生型菌株培养液上清，获得差异蛋白。对差异蛋白进行质谱分析，通过生物信息学技术预测差异蛋白的功能，对差异蛋白基因进行功能验证，鉴定青枯菌T6SS核心组成基因的功能，初步解析T6SS泌出蛋白机制。发掘新的青枯菌效应子，为设计新型抗微生物分子制剂，控制植物青枯病危害提供科学依据。

VI型分泌系统 (type VI secretion system，T6SS) 是新近发现的广泛存在于革兰氏阴性细菌中的一种分泌系统。具有 T6SS的细菌，对于动物和人类的健康都有严重的威胁，目前 T6SS的研究主要集中在动物和人类病原菌。经生物信息学分析发现，青枯菌中也存在T6SS基因簇，然而对于T6SS在青枯菌中的作用机理尚不明确。.本研究克隆了植物青枯菌1号小种GMI1000 VI 型分泌系统基因簇的8个基因，构建了8个基因的重组自杀质粒，获得了VI型分泌系统基因簇中的tssM和tssB基因突变株和互补菌株。致病力测定结果表明，tssM和tssB基因缺失突变株的致病力较GMI1000野生型菌株显著下降, 互补菌株可基本恢复突变菌株的致病力；基础生物学测定结果表明，tssM和tssB基因缺失突变株在根部及向上扩展能力、形成生物膜的能力及运动能力上较野生型都有明显的下降。.Hcp蛋白的泌出试验结果表明，野生型GMI1000菌株和互补菌株中均能够产生并泌出Hcp蛋白，突变菌株GMI1000ΔtssB中能够产生Hcp蛋白，但是无法正常泌出Hcp蛋白。TssB蛋白的亚细胞分离试验结果表明TssB蛋白在细胞膜中存在。.利用双向电泳和质谱技术分析了tssM突变体和野生型菌株GMI1000的泌出蛋白，共获得38个差异蛋白点。在GMI1000中特异性表达的蛋白差异点有15个；在tssM突变体中特异性表达的蛋白点有10个；在GMI1000中上调表达的蛋白点有3个；在tssM突变体中下调表达的蛋白点有10个。其中蛋白点592是 VI型分泌系统组成表达蛋白，与野生型GMI1000相比，其在tssM突变体中的表达量下调了2/3以上。tssM基因的缺失不仅与青枯菌的致病力密切相关，而且对泌出蛋白的种类和数量均产生了重要的影响。其中多数蛋白的功能尚不明确，这些蛋白的结构和功能将有待于进一步的研究。.青枯菌是世界范围内最具有毁灭性的植物病原菌之一，由于青枯菌的致死性和持久性强，并且具有广泛的寄主范围以及广阔的地理分布，因此造成的经济损失巨大。本研究以青枯菌GMI1000菌株T6SS中的tssM基因和tssB基因为研究切入点，更深一步地解析了植物青枯菌中VI型分泌系统的作用机理，。