贵州省病原需氧放线菌的系统分类研究及其属间快速鉴别诊断试剂盒的研发

Aerobic actinomycetes are often overlooked or missed unless there is a suspicion of some relevant infections. The taxonomic research on pathogenic aerobic actinomycetes has been found in blank in Guizhou province of China so far. In this proposal, therefore, the epidemiological and taxonomic investigation of pathogenic aerobic actinomycetes species in hospitals and soil is adapted for identifying the prevalence and geographic distribution of these microbes in the local region. The main research contents include the related strain isolation, the morphological, biochemical and molecular identifications. In addition, the susceptibility testing and animal virulence testing are developed for the analyses of some isolated medically important strains as well. Moreover, according to our previous discovery of the specific motifs in the phylogenetic study on Gordonia species, we are going to design the specific amplification primers and probes for rapid identification and diagnosis of different clinically important aerobic actinomycetes species. With the assistance of TDI-FP assay (Template-directed Dye-terminator Incorporation with Fluorescence Polarization), the synchronous detection to identify specific actinomycetes species is expected to be successful. Through the development of this diagnostic kit, the clinical detection and differentiation of aerobic actinomycetes could become convenient, rapid and reliable. The related research achievements will not only assist the local physician in correctly diagnosing the disease, but also in determining appropriate therapy for patients with these infections, and in determining the clinical significance.

病原需氧放线菌在临床上除非是已经怀疑有相应感染可能性，需氧放线菌通常会被漏诊或误诊，在西部落后地区相关研究尚属空白。本研究通过对贵州地区病原需氧放线菌的采集培养和生化形态及基因系统分类鉴定，其研究成果带动提高我省临床及检验医务人员在病原放线菌感染方面的诊断和鉴别水平，加深认识我省的病原需氧放线菌感染情况。另外我们根据前期研究中的发现，设计特异性扩增引物及探针，采用荧光偏振检测与引物末端延伸反应技术相结合，研发在同一反应体系中应用多重引物，同步检测鉴别不同放线菌属的菌种的诊断试剂盒，使得对病原菌的临床检测快速、可靠、特异及操作简单，尤其能降低多重混合感染的漏诊率和检测成本。该试剂盒的研发目前在国际国内均属首创，可以突破我国临床对于多种非结核性分支杆菌、结核分支杆菌及其他病原性放线菌的快速鉴别、鉴定和诊断的困难颈瓶，是具有科学技术创新及重大经济和社会效益前景的科技成果转化项目。

在项目执行期间，基本按照预期计划完成了贵州省各种放线菌的完善信息存取系统的建立，设计研发放线菌属间诊断试剂盒并探讨了当地及周边放线菌的系统发育情况。研究中一共收集了200多株需氧放线菌，其中采集了贵州省9个区域的3个类型土壤标本进行需氧放线菌的分离纯化和分子生物学鉴定，共获得土壤放线菌株173株，首次系统地对贵州地区土壤需氧放线菌进行了系统分析，结果显示贵州地区土壤需氧放线菌主要包括链霉菌属、北里孢菌属和诺卡氏菌属，其中优势菌属为链霉菌属，其在种间水平上存在分类多样性和地域差异性，并发现6株具有抗菌活性的放线菌菌株并对其进行了稳定性测试，为将来研究其抗菌活性物质提供最佳pH值的理论支持；在临床上共收集了75株临床病原需氧放线菌，其中从贵州地区收集到病原放线菌主要以胞内分枝杆菌及鸟分枝杆菌为主，临床诺卡氏菌主要来自北京、上海、广东等医学诊断发达地区的肺部感染患者，从而提示国内应加强中西部地区对于此类病原菌感染的诊断及鉴别能力；在菌种的分布上有明显的地域差异，这可能与贵州当地的气候条件、地理位置、医院检验人员的技术水平及患者自身的工作、生活条件等密切相关。研究中发表病原戈登氏菌属新种1个, 我们将其命名为Gordonia iterum sp. nov., 环境中微杆菌属新种1个，命名为Microbacterium sorbitolivorans sp. nov.。另外对本研究所收集的临床诺卡氏菌进行药物敏感实验，药敏实验结果显示各菌株均对阿米卡星敏感，而对亚胺培南耐药，对于其他的药物的敏感与耐药各不相同。此外，在之前研究的基础上，我们对临床常见病原放线菌的secA1基因进行扩增并将其翻译成氨基酸序列，发现多数不同属的放线菌之间存在的特异性基序，该结论为病原需氧放线菌的临床分类、诊断及致病性提供一定的实验室理论数据。设计了一种能够特异性扩增的分子信标探针，采用实荧光定量PCR方法，从而研发能够鉴别临床病原需氧放线菌中诺卡氏菌的诊断试剂盒，可克服现在病原性放线菌的快速鉴别、鉴定和诊断的颈瓶。本项目圆满完成了各项课题考核指标，发表文章25篇，放线菌相关论著1部，参加国内外学术会议发表7篇；本项目无论从项目的完成度、取得的成果，还是在争取到的外方支持及合作方面，都较好的完成了国家自然科学基金项目的各项要求及指标。