小麦孢囊线虫快速检测体系研究及田间诊断试剂盒研发

Wheat cereal cyst nematodes are the destructive pests to cereal crops and have spread all over the world. They seriously threaten and restrict the development of cereal crops production in China. The traditional diagnosis of wheat cereal cyst nematodes is inefficient, developing new technology with less time-consuming, less cost and more information will lay a foundation for accurate and effective diagnosis of wheat cereal cyst nematodes. Using H. avenae and H. filipjevi as materials, the scientific research item goes in for developing early and rapid molecular diagnostic technique of them through SCAR marker, Real-time PCR and LAMP. And this molecular diagnostic technique will be able to detect and diagnose signal H. avenae and H. filipjevi exiting in wheat root tissue and soil, which will realize early detection and control of them. Finally, basing on this molecular diagnostic technique, we will develop a rapid diagnosis and detection kit to satisfies local scientific and technical personnel needs of the pests prediction and control.

小麦孢囊线虫是世界范围内分布的禾谷类作物重要病原线虫。目前已经对我国的麦类作物生产构成了严重威胁，严重制约着麦类作物生产的发展。由于传统诊断方法的制约性，研发新的诊断速度更快、成本更低、信息量更大的诊断技术是进行该病害准确测报和有效防控的基础，且具有重要的理论和实践意义。本项目拟以经济上危害最大、形态上最难区分的H.avenae和H.filipjevi作为研究对象，运用SCAR标记、Real-time PCR和LAMP技术研究小麦孢囊线虫的早期快速准确检测和诊断的分子生物学方法，开发检测罹病植物小麦组织和土壤中H.avenae和H.filipjevi单头线虫的检测技术，研发出简便易行的田间诊断检测试剂盒，以实现尽早检测和防控，满足基层科技工作者病害测报和防控的需求。

本项目对SCAR标记、Real-time PCR和LAMP技术研究小麦孢囊线虫的早期快速准确检测和诊断的分子生物学方法进行了研究。结果表明，所设计的SCAR标记引物具有很好的特异性。对反应条件进行了优化，筛选出了最佳的反应体系。分别提取了禾谷孢囊线虫和菲利普单个孢囊和单头二龄幼虫的基因组DNA，采用10倍稀释法梯度稀释基因组DNA作为扩增模板，采用已确定的SCAR 反应体系进行灵敏度检测，结果表明该检测方法具有很高的灵敏度。. 设计了LAMP引物，建立了LAMP检测体系，对反应体系进行了优化，并进行了特异性和灵敏度试验，同时对田间样品进行了鉴定实验。将单条小麦孢囊线虫DNA进行浓度梯度稀释，并与普通PCR方法进行比较，结果表明本研究建立的禾谷孢囊线虫LAMP体系检测阈值为1/20 000条线虫DNA，PCR的检出限为1/200条线虫DNA。由此可见，LAMP检测方法具有极高的灵敏度，且特异性较强。 . 开发了Taqman MGB探针实时荧光定量PCR检测方法，采用特异性引物和探针分别对不同种群的H.avenae和Hfilipjev进行特异性扩增，获得了特异的荧光曲线，而其他孢囊线虫近缘种均无荧光曲线，从而实现了对H.avenae和Hfilipjev的快速、准确的检测和鉴定。同时，进行了该检测方法灵敏度检测，该体系的检测阈值为10ng/μl，这说明该菲利普孢囊线虫Taqman MGB探针实时荧光定量PCR体系的灵敏度非常高。