重组枯草芽孢杆菌合成甘露聚糖的调控机制研究

Mannans, a kind of functional polysaccharide with unique biological activities, have been widely used in food, medicine and pharmaceutical industries. Due to lacking effective research on identifying pathway enzymes, bottleneck steps and the regulation mechanisms of mannan biosynthesis, so it is still a challenge to construct high efficient and low cost microbial cell factories to produce mannan. In this project, based on our previous metabolic engineering platform for mannan denovo synthesis in Bacillus subtilis 168, we will analyze the expression of pathway enzymes with modular assembly and the levels of metabolic intermediates, to identify the key pathway genes and limiting steps in mannan biosynthesis pathway. Then a novel approach of combinatorial engineering of regulatory elements and pathway enzymes was employed to optimize synthetic pathways at the transcriptional and protein levels, which alleviates the bottleneck steps and fine-tunes the metabolic flux for efficient accumulation of mannan in B. subtilis host. At the same time, the dynamic sensor-regulator system was used to monitor and regulate the metabolic flow for further achieving the balance between the cell growth and mannan synthesis. The research results are helpful to understand the synthesizing and regulatory mechanism for polysaccharides, providing important theoretical references for metabolic engineering of microorganisms for synthesizing other polysaccharides.

甘露聚糖是一类具有独特生物活性的功能聚多糖，已广泛应用于食品医药等行业。然而目前对甘露聚糖生物合成途径关键酶、限速瓶颈步骤和调控机理等缺乏有效的研究，发展绿色高效、低成本的微生物合成甘露聚糖依然是一个挑战。本项目基于前期代谢工程改造食品级宿主枯草芽孢杆菌为平台，从头组装构建甘露聚糖的生物合成途径。通过对甘露聚糖的合成途径基因进行模块式组合表达，在转录水平和代谢中间物的积累水平分析和鉴定甘露聚糖合成途径的关键基因和限速步骤；运用组合改造调控元件和途径酶的新技术同时在转录翻译和酶进化上组合改造甘露聚糖合成途径，消除限速步骤和平衡代谢流。同时采用动态传感技术监测和调控竞争途径代谢流，最终建立细胞生长与目标产物合成间的供需平衡与最佳分配的调控机制，实现重组枯草芽孢杆菌细胞工厂高效合成甘露聚糖。本项目的研究结果亦将有助于为揭示其他生物多糖的合成及调控机理和代谢改造研究提供重要的指导意义和理论参考。

甘露聚糖 (Mannan) 是一种具有独特生物活性的功能性多糖，已被广泛应用食品和医药。尽管近些年来植物甘露聚糖代谢相关的基因被陆续报道，对甘露聚糖生物合成途径关键酶、限速瓶颈步骤和调控机理等缺乏有效的研究，构建绿色高效、低成本的微生物合成甘露聚糖依然是一个挑战。在本项目工作中，基于代谢工程改造食品级宿主枯草芽孢杆菌作为微生物合成平台，从头组装构建了甘露聚糖的生物合成途径，甘露聚糖的初始产量达到0.97 g/L；通过多糖红外光谱分析和单糖组分测定确定了重组菌株产生的甘露聚糖是以D-甘露糖为组成单位通过β-1,4糖苷键连接而成的线性多糖。对甘露聚糖的合成途径基因进行模块式组合表达，在转录水平分析和鉴定甘露聚糖合成途径的关键基因和限速步骤，对关键基因manC、manB、manA和pgi共表达后甘露聚糖的产量显著增加到2.5 g/L。使用葡萄糖的抑制型启动子动态感应碳源浓度实现对糖酵解途径关键酶pfkA的严谨调控表达，重新定向优化分配碳流量实现了甘露聚糖的产量显著增加到4.1 g/L。进一步通过3-L补料发酵策略，重组菌株甘露聚糖产量提高到12.6 g/L，平均分子量为6370 Da，实现重组枯草芽孢杆菌细胞工厂高效合成低分子量甘露聚糖。本项目的研究结果亦将有助于为揭示其他生物多糖的合成及调控机理和代谢改造研究提供重要的指导意义和理论参考。