OPG途径在Cd影响破骨细胞分化和骨吸收中的作用及调控机制

The cadmium pollution resulting in bone diseases, is highly contaminating the atmosphere and soil environment of Chin. In the previous study, we found that cadmium can affect differentiation and bone resorption of osteoclasts via osteoprotegerin pathway, however the mechanism has been understood poorly. Balb/c mouse and chicken are used as experimental animals in our project. To research the difference of transcription and expression of the key genes, proteins and their modified proteins involving in the process that cadmium affects osteoclasts via osteoprotegerin pathway, we apply the Real-time fluorescence quantitative PCR, Western blotting, Isobaric tags for relative and absolute quantitation，second-generation sequencing technology, flow cytometry, immunofluorescence staining, transmission and scanning electron microscopy. Afterwards, we use the gene silence or overexpression techniques to further study the function and regulation mechanisms of the proteins. The relevant protein interaction and modification sites were detected by immunoprecipitation, fusion expression, super-resolution laser confocal and mass spectrometry techniques. Finally, we verify the relevant mechanisms in vivo. The results will reveal the molecular mechanism of Cd-induced abnormity of osteoclast differentiation and bone resorption via osteoprotegerin pathway.

我国环境中的镉污染形势严峻，通过食物链系统进入机体内能导致严重的骨质损伤,破骨细胞分化和骨吸收在镉致骨代谢异常中起决定作用。申请者发现镉能经OPG途径影响破骨细胞分化和骨吸收，但其分子机制尚未明确。本项目以小鼠和鸡为实验动物，利用荧光定量PCR、Western blot、iTRAP、二代测序技术、流式细胞术、免疫荧光染色、透射和扫描电镜等技术，以OPG途径为主线，从镉对破骨细胞分化和骨吸收两方面入手，研究此过程中关键基因和蛋白及其修饰蛋白的转录与表达差异；然后通过基因沉默或过表达技术，研究该蛋白的功能和调节机制；用免疫共沉淀、融合表达、超分辨率激光共聚焦和质谱仪检测相关蛋白互作和修饰位点；并通过动物体内试验进一步验证相关机制。从而揭示Cd经OPG途径影响破骨细胞分化和骨吸收异常的分子机制，为临床预防和治疗Cd致动物骨骼的毒性损伤提供新思路。

骨骼是镉毒性作用的重要靶器官。前期研究表明，镉能增加成骨细胞RANKL的表达，同时抑制骨保护素（OPG）的表达，进而促进破骨细胞（OC）的分化，OPG能通过线粒体凋亡途径诱导OCs和OPCs发生凋亡。本研究从体内和体外揭示了镉暴露对破骨细胞分化和骨吸收功能的影响。.（1）低浓度的镉能促进OC的分化。镉增加胞浆内钙离子的浓度，激活Ca2+/CaM/CaMKs信号通路，CaM可以直接激活CaMKV/CaMKII，增加NFATc1的表达而促进OC分化。.（2）镉对破骨细胞的影响与镉暴露时间有关。发现长期镉暴露（72h）明显抑制了破骨细胞的形成和骨吸收活性，TRAP、CAII、CK、MMP-9 、NFATc1的表达水平显著降低。短期 (12 h) 镉暴露后，细胞凋亡率降低，增加了破骨细胞中LC3II的累积，加速了P62的降解过程。在破骨细胞分化后期镉暴露，骨吸收活性增加，伪足小体结构更加明显，Integrin αvβ3、Paxillin、Vinculin、PYK2和SRC的磷酸化水平的表达显著上调。表明，长期镉暴露抑制了破骨细胞的分化，而短期镉暴露更有利于破骨细胞存活。.（3）P2X7/PI3K/AKT信号通路在镉抑制破骨细胞分化的过程中发挥了重要作用。P2X7受体敲减后，长期镉暴露P2X7受体蛋白表达水平呈剂量依赖性降低，其下游PI3K/AKT信号也显著抑制，骨吸收关键蛋白的表达显著下调。过表达P2X7受体后长期镉暴露对破骨细胞分化的抑制作用显著缓解。而阻断P2X7/PI3K/AKT信号后，长期镉暴露对破骨细胞分化的抑制作用显著增强。.（4）动物镉暴露可发生骨质疏松。通过鸭胚和小鼠镉中毒模型发现，鸭对镉暴露非常敏感，短时间镉暴露即可诱导鸭骨质疏松。小鼠短期 (4个月) 镉暴露后骨相关参数及病理组织学均无显著性变化，但骨组织中可见大量的破骨细胞，成骨细胞数量减少，成骨关键蛋白和凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3的表达显著降低。长期 (15个月) 镉暴露后，骨相关参数显著降低，破骨细胞和成骨细胞数量显著降低；成骨和骨吸收关键蛋白的表达显著降低，而凋亡蛋白的表达显著增加。镉暴露显著抑制P2X7/PI3K/AKT信号相关蛋白表达。表明镉暴露可致骨质疏松，抑制破骨细胞分化是发生骨质疏松的主要原因。