NOD样受体调控破骨细胞分化在牙周炎牙槽骨吸收中的作用

Recent studies suggested that NOD-like receptors NOD1 and NOD2 were related to alveolar bone loss in periodontitis. The expression of several NLRs are found to be activated during cytokine-induced osteocalstogenesis in our previous studies.Therefore, we hypothesize that NLRs is involved in the progression of osteoclastogenesis, in turn play an essential role in alveolar bone loss in peridontitis..This program is designed firstly to observe the expression of whole NLRs in osteoclastogenesis by PCR arrays and Western blotting experiment. Then we testify the effect of NLRs on osteoclastogenesis of osteoclast precursor cells(OPCs) induced by cytokines and by co-culture with periodontal ligament fibroblasts(PDLFs), applying the technique of RNA silencing and plasmid transfection. The signal pathway involved in NLRs mediated-osteoclastogenesis will be illustrated by using the inhibitors of NF-κB and MAPKs pathway.Finally the effect of NLRs on alveolar bone loss in periodontitis will be identified. For this purpose, the NLRs which may regulate osteoclastogenesis will be selected based on results of above studies. These selected NLRs gene will be knocked out in rats by CRISR-cas9 system. Experimental periodontitis will be induced in this rat model. The level of alveolar bone loss will be analysed by micro-CT evaluation and histopathologic examination. .The results of this program will supply more evidences for our understanding the role of NLRs in peridontitis, and enrich the theory of periodontal pathogenesis. Besides, it could provide clues and set up theoretical basis for a new treat ment strategy of periodontal diseases.

最新文献显示两种NOD样受体(NLRs)的表达高低与牙槽骨吸收程度有关，我们的前期探索发现几种NLRs在破骨细胞（OC）分化过程中表达增高，推测NLRs参与调控OC分化，进而在牙槽骨吸收中发挥作用。本课题拟用PCR与蛋白免疫印迹技术全面研究NLRs在OC分化过程中的表达；分别用细胞因子刺激和破骨前体细胞（pre-OC）与牙周膜成纤维细胞（PDLFs）共培养方法诱导OC分化，通过基因沉默和质粒转染技术，研究NLRs在OC分化中的调控作用，且用阻断OC分化相关信号通路的方法研究NLRs调控OC分化的机制；采用CRISPR/CAS9制作NLRs基因敲除大鼠模型，诱导实验性牙周炎，通过micro-CT及组织学技术评价牙槽骨吸收，研究对OC分化有调控作用的NLRs对牙周炎牙槽骨吸收的影响。从而深入阐述NLRs与牙周炎的关系，丰富和扩展牙周炎致病机制的理论体系，为建立新的治疗策略提供线索和理论基础。

模式识别受体作为固有免疫反应的总枢纽，在多种感染性炎症性疾病中发挥作用，有文献提示NOD样受体与骨吸收相关。本项目旨在研究NOD样受体调控破骨细胞分化在牙槽骨吸收中的作用。.本项目筛选出NLRC5作为后续研究目标分子，分别行体内和体外研究。在研究中，建立了NLRC5基因敲除小鼠模型（NLRC5-/-小鼠），采用丝线结扎制作了实验性牙周炎，结果显示，NLRC5-/-小鼠的牙槽骨破坏重于野生型小鼠（Wild Type,WT）。为了探索其机制，体外培养了小鼠的骨髓来源单核细胞和脾细胞，发现NLRC5-/-组较WT组在诱导后破骨细胞标志蛋白表达增高，破骨细胞体积增大，数目增多，骨吸收能力更强； RAW264.7细胞在NLRC5过表达后，诱导分化为破骨细胞的数量少于对照组。说明NLRC5对破骨细胞的分化与功能具有抑制作用。这些结果证明了NLRC5能够调控破骨细胞分化，在牙周炎的牙槽骨吸收中发挥作用。.我们在完成上述研究目标外，还对NLRC5在成骨细胞调控与全身骨代谢中的作用进行了研究，并获得重要突破。在本项目中我们观察到，NLRC5-/-小鼠生长发育迟缓，其骨骼明显小于WT小鼠，股骨的骨小梁密度降低，破骨细胞数量增多；通过去势制作骨质疏松模型，发现NLRC5-/-小鼠去势后股骨吸收显著高于WT小鼠；在颅骨缺损模型中，发现NLRC5-/-小鼠新生骨少。这些结果说明，NLRC5-/-小鼠较WT小鼠骨骼发育迟缓，不仅破骨能力活跃，还存在成骨能力下降问题。为了进一步验证NLRC5在成骨细胞分化方面的作用，使骨髓来源间充质干细胞过表达NLRC5，发现成骨细胞标志蛋白显著增高，在矿化诱导后，矿化结节增多；而敲低NLRC5后，矿化减少。提示NLRC5对于成骨细胞分化具有正向调控作用。.本项目首次发现NLRC5在生长发育、骨质疏松及炎症性骨吸收等多方面参与了骨代谢的调控，证明NLRC5通过抑制破骨、促进成骨来调节骨代谢。这些发现拓展了我们对模式识别受体与骨代谢关系的认识，阐明了骨免疫学的复杂调控机制，为炎症和骨代谢的交叉点提供了新证据，并为未来药物开发提供了新的靶点和理论基础。