霍乱弧菌草酰乙酸脱羧酶晶体结构与其脱羧和钠离子跨膜转运功能体现

由霍乱弧菌（Vibrio cholorae）引发的霍乱是一种急性腹泻并威胁人类生命的恶性疾病，该菌能在厌氧情况下利用柠檬酸脱羧反应而获得能量。在柠檬酸脱羧过程中,位于该菌细胞膜上一个重要的草酰乙酸脱羧酶复合体(由α、β、γ亚基组成)，具有催化草酰乙酸脱羧形成丙酮酸同时转运钠离子到细胞外形成钠离子跨膜梯度的功能，从而为霍乱弧菌生长活动提供能量及动力，但其具体作用机制目前仍不清楚。本项目将主要运用结构生物学及生物化学方法从不同结构层次上去解析霍乱弧菌草酰乙酸脱羧酶复合体的结构：首先对该酶完整的α亚基的三维结构的进行解析，其次我们对αγ次级复合体以及整个草酰乙酸脱羧酶复合体的结构进行解析。以期具体阐明草酰乙酸脱羧酶复合体的组装结合方式，该酶复合体催化草酰乙酸的羧基转移和脱羧以及钠离子的跨膜转运机理，以及为阐明含有这类酶的细菌在特定的厌氧环境中获取能量的机制提供直接的三维结构证据。

草酰乙酸脱羧酶是一种催化草酰乙酸脱羧产生丙酮酸及二氧化碳的酶，包括三种蛋白组成的酶蛋白复合体及可溶性草酰乙酸脱羧酶两种。其中只有复合体中草酰乙酸羧基转移酶结构域有结构的报道。克隆表达并纯化得到了可溶性草酰乙酸脱羧酶Cg1458，并鉴定了其生化特性。培养了Cg1458的野生型蛋白的晶体及其与抑制剂草酸共结晶的复合体的晶体，分别解析了其1.9Å和2.0Å的晶体结构。发现在草酸复合体晶体中存在一段在野生型晶体中缺失的loop区，这段loop区可以作为盖子，在底物进入活性中心时阻断底物通道，在完成反应循环后打开使产物释放。通过对Cg1458结构进行分析，找到了一些可能的催化位点，并对其进行了定点突变，分别纯化了突变体蛋白并测定其草酰乙酸脱羧酶活力，结果显示除Cg1458 E76A突变体还剩余35%酶活力外，其余突变体均丧失酶活力。根据Cg1458及突变体的生化特性及两种构象的结构，并结合分子模拟实验，提出Cg1458中的盖子结构域是一种具有催化活性的盖子结构域，为一种Glu-His-water三联体的催化机制。通过对FAH家族蛋白已经解析的晶体结构的比较及大规模的同源序列比对，发现这种三联体的催化机制是一种在FAH家族蛋白中催化C-C键水解的通用机制。克隆了来源于霍乱弧菌，沙门氏菌，海洋耐热菌等不同来源的草酰乙酸脱羧酶复合体的基因，并在大肠杆菌中异源表达。获得了来源于霍乱弧菌及沙门氏菌的草酰乙酸脱羧酶复合体的表达产物，并对来源于沙门氏菌的草酰乙酸脱羧酶进行了特性鉴定。为了解析这些相关蛋白的晶体结构，还构建和表达了草酰乙酸脱羧酶的α亚基及αγ次级复合体，并对获得的α亚基及αγ次级复合体进行结晶，获得了αγ复合体的晶体；为获得稳定的草酰乙酸脱羧酶的复合体，对草酰乙酸脱羧酶的γ亚基及β亚基的跨膜区分别突变成半胱氨酸，然后利用cross-linking方法研究它们之间的相互作用，明确相互作用位点，然后通过引入二硫键以达到稳定其复合体的目的，到目前为止还未找到相互作用的位点，这部分工作将来需要进行更深入的研究。由于αγ亚基复合体相对比较稳定，并且容易得到，但β亚基比较容易从整个复合体中解离，因此我们对在β亚基上引入组氨酸标签进行了研究，结果发现组氨酸标签对于复合体的表达及活性有非常大的影响，发现在β亚基C端，N端及第2-3螺旋之间的区域引入histag均会导致复合体或β亚基的不表达，