光驱动质子泵变形菌视紫红质（Proteorhodopsins）的晶体结构及质子转运机理的解析

变形菌视紫红质(Proteorhodopsin,PR)是由7个跨膜α- 螺旋和视黄醛组成的一类光驱动的质子泵。为了阐明PR的质子转运机理及诠释其特性，为将来对PR的潜在的应用奠定基础，需要获得高解析度PR的晶体结构。申请人在刚结题的青年基金的资助下，已经获得了能够衍射到3.3?的PR晶体，并收集到完整的衍射数据，但通过分子置换的方法无法解析其结构。因此，本课题拟通过优化PR以及硒代蛋氨酸PR的结晶条件，制备PR的重原子衍生晶体及获得PR的电镜结构等，来解决PR结构解析中的相位问题，并最终获得更高的PR的晶体结构，此外，我们还将根据PR的晶体结构通过定点突变方法对PR进行突变研究，从而最终阐明PR的质子转运机制，并对其特性作出科学的解释。这将为PR未来的可能的实际应用提供重要的科学依据。

变形菌视紫红质(Proteorhodopsin, PR)是由7个跨膜α- 螺旋和视黄醛组成的一类光驱动的质子泵。为了阐明PR的质子转运机理,本项目中，我们用Ni2+亲和层析方法纯化大肠杆菌表达产物，运用气相扩散方法，成功优化了蛋白的结晶条件，获得了高质量的HOT75BPR_D97N天然蛋白的晶体，同时又制备了D97N硒代甲硫氨酸衍生蛋白晶体，运用Se-SAD的方法成功确定了相位，首次解析了BPR蛋白的晶体结构，晶体最高分辨率为2.7 Å。同时运用分子置换的方法解析了另外一种BPR野生型的2.3 Å的晶体结构。.这两种BPR单体分子均由7个ɑ-螺旋构成，生色团视黄醛位于7个跨膜螺旋之间。它们与其他视紫红质的结构存在较大的差异。BPR中螺旋B-C之间的loop很短，缺少了其他微生物视紫红质结构中都存在的β片层，使得质子释放基团附近形成一个空腔，直达细胞外表面。PR中螺旋D-E loop上的一个PR中保守的Glu142参与了质子的释放，通过三个酪氨酸残基95、208和224的强氢键作用力固定，与Arg94一起将质子释放到胞外。在质子由席夫碱转移至质子受体过程中也缺失了BR中的关键水分子W402。.HOT75BPR为C5五聚体，分子间存在几组相互作用分别为Trp34-His75已及N末端Asp22的羧基基团与相邻单体的Thr91，Val92和Phe93形成的氢键，这些分子间相互作用在其他视紫红质中未见报道。为了明确这些分子间作用力，运用分子生物学，生物化学及结构生物学手段，我们发现这些分子间的相互作用是通过保守的His75调节BPR的pKa，这些分子间作用也是维持BPR的高效质子转运功能所必须的，解析了D22V突变体的晶体结构，推测了其调控pKa和影响质子转运的机制。.105位氨基酸（Gln/Leu）的转换导致PR的吸收光谱由蓝光转变成绿光，为了明确105位调控光谱吸收的机制。我们解析了wt，105C，105M和105F四种晶体结构并对他们进行了比较。另外我们还构建了一种用于检测保守的PR基因片段的质粒，并建立了一种检验PR基因的方法，运用该方法分离到第一株含PR的淡水微生物。并对该PR的功能及特性进行了研究，发现其在宿主菌体内可能不是起质子转运功能的，而是一种感光性的PR。运用该方法我们还分离到多种含PR的淡水微生物。