ASPP2通过促进PINK1磷酸化p53而抑制CD133+肝癌干细胞产生和功能的分子机制研究

The development of hepatocellular carcinoma (HCC) is closely related to the development of liver cancer stem cells (LCSCs). Our previous studies show that Apoptosis-stimulating protein of p53-2 (ASPP2) has an ability to inhibit the development and function of CD133+ LCSCs. The effects of ASPP2 on inhibiting CD133+ LCSCs are associated with the function of ASPP2-N terminal on promoting PINK1-mediated phosphorylation of p53 at S392 site, and ASPP2-p-p53(S392) complexes on inhibiting Nanog transcription. Our previous study also shows that ASPP2-p-p53(S392) complexes contain other proteins. Here, we will use truncated N-terminal ASPP2 plasmids to find the key amino acid sequence of ASPP2 which promotes PINK1-mediated p53 phosphorylation at S392 site. GST-pull-down assay will be used to analyze how ASPP2-p-p53(S392) complexes form. At last, in vitro and in vivo assays will be employed to detect the effects and mechanisms of ASPP2-p-p53(S392) complexes on inhibiting the development and function of CD133+ LCSCs, in the situation of inhibiting or promoting the formation of ASPP2-p-p53(S392) complexes. Through the above experiments, this project will elucidate the role of ASPP2 in inhibiting LCSCs development, and it also will provide theoretical support and previous data for researching the effect of recombinant adenovirus-ASPP2 on curing HCC.

肝癌发生与肝癌干细胞（LCSCs）的产生密切相关。我们前期研究发现p53凋亡刺激蛋白2（ASPP2）对CD133+ LCSCs产生和功能有明显抑制作用，其机制与ASPP2-N端促进PINK1磷酸化p53的S392位点、以及包含其他结合蛋白的ASPP2-p-p53(S392)复合物抑制Nanog转录有关。本课题将通过不同长度的ASPP2-N端来寻找ASPP2促进p53磷酸化的关键氨基酸序列；通过GST-pull-down实验阐明ASPP2-p-p53(S392)复合物构成机制；最后利用体内、体外实验，通过促进和抑制ASPP2-p-p53(S392)复合物组成蛋白的表达，来分析该复合物对CD133+ LCSCs产生和功能的抑制效应、及其相关分子机制。通过以上实验，该课题将阐明ASPP2在机体抑制LCSCs产生中的作用和机制，并为研究ASPP2腺病毒治疗肝癌提供理论支持和研究基础。

肝癌肿瘤干细胞（LCSC）是导致肝癌发生、肝癌对放化疗无效和临床耐药的重要原因。有观点认为消灭肿瘤干细胞是治愈肿瘤的关键。但调控LCSC产生和功能的机制和对之有效的消灭方法还有待研究。.该课题旨在研究ASPP2促进PINK1磷酸化p53的机制，以及ASPP2如何与-p53(pS392)构成复合物并抑制NANOG转录的机制，从而阐明一个新的调控LCSC产生和功能的机制并基于此初步探索可能有效的杀灭LCSC的方法。.结果显示：ASPP2蛋白的N端序列是促进PINK1磷酸化p53的S392位点关键，p53(pS392)再通过抑制NANOG转录而下调LCSC的水平和功能。体内实验表明促进该N端肽段表达可显著抑制LCSC的致瘤能力。我们鉴定出ASPP2-p53(pS392)复合物中的三个蛋白都是可以被募集的共激活因子（coactivator）。其中两个共激活因子是发挥空间位阻抑制NANOG转录的关键，促进这两个激活因子过表达均可明显抑制LCSC的致瘤能力。.ASPP2-p53(pS392)复合物的组成及各组分之间的结合关系，以及ASPP2的N端肽段序列和两个共激活因子抑制LCSC的至瘤能力是该课题的关键数据。这些结果将为开发消灭LCSC从而治疗肝癌提供新的理论基础和实验室数据。