乳糜微粒定向介导TK基因载体系统对肝癌杀伤作用

新型非病毒载体的研究对靶向基因治疗理论的突破具有重要意义。本项目利用乳糜微粒构建高效、高靶向性、高安全性的新型基因治疗载体体系，用配体-受体亲和性的富集作用和肝癌细胞选择性启动子(AFP启动子)开关提高载体的靶向性，研究TK基因对肝癌细胞的杀伤作用。内容：分离、提取制备含有载脂蛋白E（apoE）的乳糜微粒作为运载体Ⅰ；构建含有TK杀伤基因、AFP启动子和EGFP报告基因的DNA载体Ⅱ。将运载体Ⅰ和DNA载体Ⅱ结合，制备一种新型的双靶向性载体复合物。其中，运载体Ⅰ旨在提高载体复合物在肝细胞（包括肝癌细胞）内的富集度；载体Ⅱ可使杀伤基因在肝癌细胞中特异性表达，使肝癌细胞凋亡或死亡。课题拟在实验中以DNaseⅠ和无细胞血浆分别检验载体复合物的稳定性，以EGFP表达情况检验其转染效率，比较肝细胞和肝癌细胞的凋亡及死亡率来检测双靶向治疗体系杀伤肝癌细胞的作用，是肝癌靶向基因治疗载体研究的新尝试。

项目背景：在原发性肝癌中,肝细胞肝癌的发生率约为90%，每年全世界会有100万人死于这种疾病。随着HBV和HCV的传播，发生肝癌的人数还会不断增加。传统的化疗方法以及放射治疗方法对于肝癌的治疗效果并不理想。虽然外科手术切除肝癌或者肝脏移植是最佳的治疗方法，然而仅有少数患者具备条件可以获得满意的手术治疗效果。因此，对于肝癌的治疗，我们急需一种新的治疗手段。.研究内容：本课题制备两类载体，一类为富含有apoE（肝细胞膜ApoE受体的配体）的CM残体作为具有携载和跨膜功能（CM残体可被肝细胞摄取）的基因运载体Ⅰ，另一类为含有TK杀伤基因、AFP启动子和EGFP报告基因的DNA载体Ⅱ。将载体Ⅰ和DNA载体Ⅱ结合，制备一种新型的双靶向性载体复合物。.在具体的课题实施中，由于CM残体作为载体的转染效率较低，将实验改为以apoE修饰的脂质体为载体进行试验。后期又进一步探索了Survivin 启动子调控自杀基因对肝癌细胞的杀伤。.结果 使用lipoplexes和apoE-lipoplexes运载pAFP-IRES2-EGFP质粒转染HL-7702细胞的转染效率分别为41.7±0.44%和45.9±0.61%，转染HepG2细胞的转染效率分别为4.7±1.45%和13.8±2.09%，转染HuH-7细胞的转染效率分别为21.0±0.61%和51.5±1.85%，转染Li-7细胞的转染效率分别为18.63±0.57%和28.93±0.50%，apoE-lipoplexes对细胞的转染效率显著高于lipoplexes，（P<0.05）。在AFP启动子调控下，HSVtK自杀基因在AFP阳性的HepG2、HUH-7肝癌细胞中表达水平较高，而在AFP阴性的HL-7702肝细胞中表达量很低（P<0.05）。使用G418试剂成功筛选、获得稳定转染HSVtK基因的HepG2肝癌细胞株（HepG2-TK）；随着GCV剂量增加，HSVtK自杀基因对HepG2-.TK肝癌细胞的杀伤作用逐渐增强（P<0.05）。.结论：成功制备出特异肝细胞的基因运载载体，且具有双重靶向性，能很好的靶向杀伤肝癌细胞。为肝癌靶向基因治疗提供了实验依据。