L-FABP对肠上皮细胞内乳糜微粒组装的作用及机制研究

乳糜微粒是日粮脂肪被转运出动物肠上皮细胞，进入循环系统的重要载体。但是L-FABP对乳糜微组装的作用及机制尚不清楚。本研究提出L-FABP通过介导长链脂肪酸进入肠上皮细胞核激活核受体PPARα，从而上调靶基因DGAT1和MTP表达，促进肠上皮细胞乳糜微粒组装和分泌的假设。通过构建超表达L-FABP基因的Caco-2肠上皮细胞系，采用特异性与细胞器结合的荧光探针，以及荧光免疫方法标记细胞内L-FABP蛋白，对L-FABP蛋白在亚细胞器（线粒体、内质网/高尔基体、溶酶体、细胞核）定位。通过超表达和RNA干涉L-FABP基因，从正反两方面研究L-FABP对长链脂肪酸进入细胞核的影响，测定PPARα、DGAT1和MTP基因和蛋白表达量；同时，分析L-FABP对肠上皮细胞合成甘油三酯、载脂蛋白apoB-48、以及分泌乳糜微粒的影响。通过研究，将进一步阐明L-FABP在肠上皮细胞内转运脂肪的分子机理。

课题组通过三年的研究工作，完成情况及成果如下：1、成功建立transwells嵌入式培养技术。成功观察到了形成致密的单层膜结构，微绒毛形态和细胞间紧密连结都与小肠上皮细胞类似，跨膜电阻、碱性磷酸酶以及功能性蛋白（L-FABP）的表达都达到要求，极性分化完全的Caco-2细胞可以作为研究小肠营养物质吸收代谢的体外模型，用于后续脂质代谢的相关实验； 2、研究了不同饱和度、不同浓度的长链脂肪酸调控肠道上皮细胞Caco-2乳糜微粒组装和分泌的差异机制。细胞培养21d后，换用配制好的放射性标记的400 μM [1-14C]油酸, [1-14C] EPA和[1-14C]DHA细胞培养液分别处理细胞，36h后收集细胞培养液，薄层层析法测定细胞TG的合成和分泌，以及超速离心法测定CM的分泌。结果显示油酸处理组CM分泌、TG重新合成及分泌、以及ApoB48的分泌均显著高于EPA和DHA组（P<0.01）；DHA组CM分泌、TG重新合成及分泌、以及ApoB48的分泌均显著低于EPA处理组（P<0.01）。结论：与油酸相比，长链n-3多不饱和脂肪酸（PUFA）尤其是DHA，能够通过降低肠上皮细胞内甘油三酯合成、载脂蛋白ApoB48的分泌从而降低乳糜微粒的分泌量。3、研究了不同饱和度、不同浓度的长链脂肪酸对肠道上皮细胞L-FABP等脂肪酸转运相关基因的调控作用。400 μM的C16:0 (PLA)、EPA和DHA分别处理细胞，24h后收集细胞培养液，采用定量PCR方法测定细胞内脂肪酸转运相关基因（PPARα、CD36、L-FABP、DGAT1、和MTP）mRNA的表达量。结果表明：n-3多不饱和脂肪酸（PUFA）EPA和DHA处理组相对于PLA处理组，下调CD36基因表达，抑制脂肪酸的摄入；上调细胞内L-FABP等脂肪酸相关转运基因的表达，从而促进了脂肪酸的转运，且DHA作用强于 EPA；4、成功构建了L-FABP结合蛋白超表达和RNA干涉的载体。为进一步研究L-FABP蛋白在肠上皮细胞内的功能奠定基础。总之，研究表明肠道上皮细胞内L-FABP受到日粮中不同来源的脂肪酸调控; 相对于油酸，L-FABP蛋白转运的n-3多不饱和脂肪酸（EPA和DHA）能够降低甘油三酯的合成，以及抑制载脂蛋白ApoB48的分泌，从而减少Caco-2细胞组装和分泌乳糜微粒。