RIP1激酶活性依赖的Bid 剪切及Bax/Bak活化在介导细胞程序性坏死中的作用及其调控机制

TNFα can either induce apoptosis, or induce necroptosis when the activation of caspase-8 is inhibited by pan-caspases inhibitor z-VAD. Necroptosis is a specialized pathway of programmed necrosis, however the molecular mechanisms and signal transduction pathways of necroptosis are mostly less-defined. Recent studies indicated that, just like apoptosis, there are two necrosis-inducing pathways as well. The extrinsic signal is initiated by the assambly of TNFα-induced RIP1/RIP3/MLKL necrosome, leading to the activation of mitochondrial phosphatase PGAM5 and mitochondrial fission factor Drp1. Whereas, the intrinsic necrosis-inducing signals, such as ROS, can directly activate PGAM5 and Drp1 independent of RIP1/RIP3/MLKL. The activation of PGAM5 and Drp1 leads to abnormal mitochondrial fission and necrosis. In this study, we will investigate the important role of TNFα-induced and RIP1-dependnent cleavage of Bid and Bid-dependent activation of Bax/Bak on regulation of PGAM5 and Drp1, we will also investigate except Casp-8, whatelse enzyme involves Bid cleavage, and whether casapase-dependent activation of Bax/Bak or the downexpression of Bcl-xL could affect the PGAM5/Drp1 complex in a way independent of RIP1/RIP3/MLKL complex. These results will help to illucidate the pro-necrosis or anti-necrosis effects of Bcl-2 family proteins on necroptosis, and find nevol molecular targets which can regulate necroptosis.

TNFα介导的信号具有多样性，既可以促进细胞生存，也可以诱导细胞凋亡及坏死；但对坏死的调控机制及其相关信号转导网络尚未完全明了。新近的研究显示细胞坏死同细胞凋亡一样存在外源死亡受体及内源线粒体介导的信号通路，外源死亡受体及RIP1/RIP3介导的信号最终通过促进线粒体分裂而诱导细胞坏死；而内源线粒体介导的细胞坏死则涉及已知的Bcl-2家族促凋亡蛋白，但这些蛋白最终如何介导细胞坏死，是否也涉及对线粒体分裂的调控尚不得而知。我们前期的研究首次发现，在存在组成性Ripoptosome的L929细胞，TNFα可以通过RIP1激酶活性依赖的Bid蛋白剪切及Bax/Bak活化诱导RIP3非依赖的细胞坏死。本研究将继续探讨RIP1激酶活性涉及Bid剪切的分子机制、寻找除Casp-8之外在坏死条件下介导Bid剪切的酶以及Bid剪切促进Bax/Bak活化对线粒体分裂及细胞坏死的调节，阐明坏死调控的新机制。

L929细胞在肿瘤坏死因子（TNF）诱导的细胞死亡、特别是近年来有关程序性坏死的研究中是最常用的细胞模型之一。 我们的研究发现不同来源的L929细胞，其对TNF诱导的细胞死亡方式不尽相同。其中L929-N细胞呈现经典的细胞坏死特性，表现为RIP1激酶抑制剂Nec-1可以完全拮抗TNF诱导的细胞死亡，而泛caspases抑制剂Z-VAD可以促进细胞的死亡。而L929-A细胞却表现为RIP1激酶抑制剂Nec-1可以完全拮抗TNF诱导的细胞死亡，而泛caspases抑制剂Z-VAD也可以抑制细胞死亡，表明在L929-A细胞诱导了RIP1激酶活性依赖的细胞非经典凋亡（经典的细胞凋亡不依赖于RIP1激酶活性）。我们对L929-A和L929-N细胞进行了比较研究，结果发现与L929-N细胞相比， L929-A细胞仅有微量RIP3蛋白的表达，且仅有少量可诱导性TNF的表达，此外该细胞中存在由FADD、RIP1及Caspase-8构成的组成型Ripoptosome复合体，且在TNF的诱导下，RIP1与Caspase-8的结合显著增强，并进一步介导了RIP1激酶活性和Caspase-8依赖的Bid剪切。抑制RIP1激酶活性、敲低Caspase-8或敲低Bid蛋白均可完全保护细胞免于TNF诱导的细胞死亡。通过对线粒体各组分蛋白的检测，我们发现这种TNF诱导的RIP1激酶依赖的Bid剪切发生于线粒体外膜，通过剪切Bid而将细胞的死亡信号传递到线粒体。这种tBid所介导的下游信号也与经典的线粒体凋亡信号通路完全不同，其并不能介导线粒体细胞色素C的释放及下游Caspase-9、Caspase-7、 Caspase-6及 Caspase-3的活化，敲低Caspase-9和Caspase-3也不能抑制细胞的死亡。这种RIP1依赖的Bid剪切其下游作用位点是直接影响线粒体呼吸链复合体III的功能，伴随线粒体复合体III的功能抑制，细胞出现ROS聚集、细胞内钙离子浓度上升、线粒体膜电位下降并导致细胞死亡。这些结果提示在采用L929细胞模型研究细胞坏死时需更加谨慎，并阐明了TNF诱导RIP1激酶依赖的Bid剪切介导细胞发生非经典凋亡的分子机制。