小肝癌合并胆管癌栓起源于肝干细胞的实验研究

最近研究（包括我们）提示肝细胞癌和肝内胆管癌可能存在共同的胆管末梢肝干细胞起源，那么在解剖发生上肝细胞癌能否罕见原发于肝内胆管？近年研究（包括我们）表明胆管癌栓可发生于肝癌早期甚至原发瘤不能被发现的情况下；在小肝癌合并胆管癌栓中，我们初步发现极少数肿瘤细胞具有某些肝干细胞特征。因此，我们设想小肝癌并发的"胆管癌栓"本质上为原发灶，源于肝干细胞的恶性转化。本研究拟采用Thy-1、CD133和CD45分选该类肿瘤组织中的各细胞亚群，比较它们的生物学行为、干细胞表型及干基因表达的差异，以求明确该类肿瘤中是否存在肝癌干细胞特性的亚群；进而采用功能基因芯片分析其与癌旁组织中胆管末梢肝干细胞基因的差异表达，然后观察突变型 β-catenin 基因对肝干细胞生物学行为的影响，以明确两者的关系。本项目将为我们继续探索"共同起源"这一命题提供新的研究模型及途径，同时也为"肝干细胞成熟受阻"学说提供重要依据。

肝癌干细胞及其独特的生物学特性与肝癌侵袭、转移、复发及化疗抵抗等临床病理特征紧密相关。在35例合并胆管癌栓的肝癌组织中，免疫组化显示CD90、CK19等肝癌干细胞标志高表达；且与肿瘤的分化程度呈负相关(P<0.05)。在肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)合并门脉癌栓(portal vein tumor thrombosis, PVTT)组织的原代培养中，我们发现癌栓组织细胞具有较强的增殖和侵袭能力；采用流式细胞仪检测其中的CD90+肝癌干样细胞数，及相继的qRT-PCR、Western blot和侵袭实验，结果显示CD90+细胞含量及侵袭性与CK19及SALL4等肝癌干细胞相关基因及蛋白表达量均呈：PVTT细胞组>HCC-PVTT(+)细胞组，HCC-PVTT(+)细胞组>HCC-PVTT(-)细胞组(P<0.05)，上述癌干细胞标志物与其侵袭性呈正相关，表明HCC-PVTT中存在肝癌干样细胞，且CD90+细胞具有癌干特性。在人源肝癌细胞系MHCC97H研究中，体外增殖、克隆形成与裸鼠体内成瘤实验证实CD90+亚群具备肝癌干细胞的生物学特性；继而采用特异抑制剂LY294002，探讨PI3K/AKT途径调控CD90+亚群比例及其癌干特性的潜在机制。与CD90-亚群比较，CD90+亚群比例下降，体外增殖、克隆形成及裸鼠体内成瘤均显著减弱，相应的CD90、SHP2及P-AKT蛋白表达明显减少(P<0.05)；提示CD90+亚群癌干特性的维持依赖于PI3K/AKT通路。进一步探索LY294002在肝癌5-FU化疗中的增敏效应，结果显示LY294002优先抑制CD90+细胞的增殖，其IC50在CD90+细胞、MHCC97H成球细胞及MHCC97H贴壁细胞中依次为14.86μmol/L、64.64μmol/L及598.35μmol/L；LY294002显著降低前两者中CD90、Nanog、SALL4及SHP2的表达，呈浓度依赖性；联合LY294002(10μmol/L)干预明显增强5-FU对前两者增殖的抑制能力，且显著降低其相关肝癌干基因及蛋白的表达(P<0.05)。本项目为我们下一步回归人新鲜样本HCC合并PVTT或胆管癌栓中肝癌干细胞的原代培养、生物学特性及其调控通路与相应精准靶向治疗的医学转化提供了部分理论和实验依据。