弓形虫多态效应分子GRA15Ⅱ调节巨噬细胞极化及其抗肝细胞癌作用的研究

Tumor associated macrophages are the most abundant immune cells within the tumor microenvironment and play a crucial role in tumor development. Plasticity and diversity have long been known to be hallmarks of macrophage differentiation pathway. Tumor cell have been found to express a set of molecules to polarize tumor associated macrophages into an M2 state, which promote tumor growth、invasion and metastasis. Toxoplasma polymorphism effectors GRA15Ⅱ drive macrophages to M1 through NF-κB pathway in order to change the response of M2/Th2. It is hypothesized that GRA15Ⅱ could activate tumor associated macrophages from M2 to M1 phenotype to kill tumor and anti-angiogenesis. The present study will observe the ability of GRA15Ⅱ drive macrophages polarization in the tumor microenvironment by using macrophage transfection with recombinant GRA15Ⅱ adenovirus, transwell culture of polarized macrophages with tumor cell of hepatocellular carcinoma, and in site injection in mice model of tumor. The results will provide a deep insight into the mechanism of immunoregulation of tumor associated macrophages and a novel strategy for drug development and immunotherapy for cancer. So far, no relevant approach has been available.

肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境内浸润最为丰富的免疫细胞，在肿瘤生物行为学上发挥重要作用。已知巨噬细胞具有可塑性，肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤细胞分泌的相关因子的作用下极化为M2型，促进肿瘤增殖、侵袭和转移，因此成为肿瘤免疫治疗的重要靶点。弓形虫多态效应分子GRA15Ⅱ能够通过NF-κB途径驱动巨噬细胞向M1极化，其有可能逆转肿瘤相关巨噬细胞从M2向M1极化，改变微环境中M2/Th2的优势应答，发挥杀伤肿瘤细胞和抑制血管生成功能。本研究采用我国的弓形虫优势基因型虫株多态效应分子GRA15Ⅱ重组腺病毒转染巨噬细胞，与肝癌细胞共培养、肿瘤原位注射小鼠肝癌模型等，观察弓形虫多态效应分子GRA15Ⅱ在肿瘤微环境中调节巨噬细胞的M1极化，延滞肿瘤进展的作用，深入探讨肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节机制，为肿瘤免疫治疗提供新思路和新策略，为开发新药物提供基础。此项研究国内外未见报道。

肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境内浸润最为丰富的免疫炎性细胞，在肿瘤生物行为学上发挥重要作用。已知巨噬细胞具有可塑性，肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤细胞分泌的相关因子的作用下极化为M2型，促进肿瘤增殖、侵袭和转移，因此成为肿瘤免疫治疗的重要靶点。弓形虫多态效应分子GRA15Ⅱ能够通过NF-κB途径驱动巨噬细胞向M1极化，其有可能逆转肿瘤相关巨噬细胞从M2向M1极化，改变微环境中M2/Th2的优势应答，发挥杀伤肿瘤细胞和抑制血管生成功能。因此，我们探索了弓形虫GRA15Ⅱ在体外诱导的M1及其对小鼠模型肝癌增殖、侵袭和转移的抑制作用。在此，我们构建了重组质粒pegfp-gra15II，并将其连接到慢病毒(Lv)载体上，转染RAW264.7。结果显示，转染后的巨噬细胞极化至M1。LV-gra15II-Mφ与Hepa1-6细胞共培养对肿瘤细胞的迁移和侵袭有明显的抑制作用，基质金属蛋白酶(MMP)-9和MMP-2表达降低，但Hepa1-6细胞无明显凋亡。随后，在脾脏和肿瘤组织中均发现了接种到C57BL/6荷瘤小鼠体内的巨噬细胞，巨噬细胞极化后，肿瘤生长受到严重抑制。特别是与肿瘤恶性行为密切相关的白介素-6 (IL-6)表达在肿瘤组织中明显抑制。此外,在分离的脾细胞中TNF-α和IL-12 mRNA的表达增加,而IL- 6和IL- 10 mRNA表达下调。我们的结果表明，ToxoGRA15II效应分子可能通过其在肿瘤和脾脏组织中的相关细胞因子谱，诱导巨噬细胞向M1极化，并对肿瘤生长产生限制性作用。此外，通过小鼠基因组芯片检测和免疫共沉淀实验结果显示ToxoGRA15II通过直接结合TRFA6激活NF-κB途径，进一步揭示肿瘤微环境中ToxoGRA15II抑制肿瘤生长的分子机制。弓形虫效应蛋白分子GRA15Ⅱ因其对巨噬细胞的早期激活和对哺乳动物的非毒性作用，具有增强宿主天然免疫对抗肿瘤发展的新型治疗策略的潜在价值。