弓形虫感染宿主细胞经STAT3-miR-17s－Bim信号通路抑制线粒体途径凋亡的研究

弓形虫与宿主细胞之间的相互作用一直是寄生虫/宿主关系研究的热点。近年来miRNAs的基因转录后调节功能已引起人们的关注。弓形虫感染能否干扰宿主细胞miRNAs，从而改变其蛋白质表达，国内外未见报道。我们先前筛选和预测了人类miR-17～92基因簇启动子序列存在 STAT3结合位点，Bim 3'-UTR具有miR-17s靶区域，提出"弓形虫感染宿主细胞经STAT3-miR-17s-Bim信号通路抑制细胞线粒体途径凋亡"的假说。本课题利用人类miRNA芯片分析不同基因型弓形虫感染后宿主细胞miRNAs表达谱；通过RT-PCR、Western blot等动态观测弓形虫感染后宿主细胞内目的基因和蛋白的表达水平，构建荧光素报告基因分析STAT3-miR-17s-Bim之间的关系，探讨弓形虫通过此信号通路抑制宿主细胞线粒体途径诱导的凋亡，旨在深入探讨弓形虫的致病机制，并为疫苗和新药研发提供新思路。

弓形虫是一种人畜共患、广泛传播、专性寄生于温血动物有核细胞内的机会性致病原虫。虫体的侵入，作为一种细胞自身的“异物”，可改变宿主细胞的内环境，这必然会引起宿主细胞miRNAs表达水平的改变。利用星状孢子素诱导细胞调亡途径，弓形虫感染后利用流式细胞仪检测细胞调亡情况。利用Western blot观察凋亡途径中关键蛋白Bim的表达情况。利用人类miRNAs基因芯片和qRT-PCR，分析弓形虫感染正常人巨噬细胞后miRNA表达谱及其改变情况。通过生物信息学软件分析与Bim相关miR17~92 miRNAs的改变情况及miR17~92基因簇启动子上游转录因子STAT3的结合位点。然后利用Western blot观察弓形虫感染后细胞内STAT3（pSTAT3）的变化。构建miRNA-17~92基因簇启动子区域的荧光素酶报告基因（pGL3-Basic载体），与表达STAT3的表达质粒（pEZ-M02-STAT3-WT, pEZ-M02-STAT3-C）共转染至Mɸ细胞内，检测报告基因活性；构建Bim 3’-UTRs片段(Bim-3′UTR-1, Bim-3′UTR-2和Bim-3′UTR-3）的荧光素酶报告基因（pSI-CHECK2载体），与表达miR-17~92的质粒（pEZ-M02-miR-17~92）或 miR-17-5p抑制体及miR-20a 抑制体共转染至Mɸ细胞内，检测报告基因活性。结果显示（1）弓形虫感染情况下Mɸ的早期凋亡率明显下降；（2）弓形虫感染后导致Mɸ内Bim表达下降；（3） 通过miRNA基因芯片分析，弓形虫感染导致Mɸ内miR17~92基因簇编码的microRNA表达升高；（4）荧光素酶实验结果显示，miR17~92基因簇所编码的miRNAs通过可结合Bim 3′UTR区，抑制蛋白的表达；Western blot结果显示miR17~92 miRNAs过表达或抑制表达均能够抑制或促进Bim蛋白的表达；（5）荧光素酶实验结果显示，pSTAT3可以结合miR17~92基因簇启动子，促进其miRNAs的表达量。Western blot和qRT-PCR结果显示STAT3的活化或抑制均能够促进或抑制miR17~92 miRNAs的表达及其对Bim蛋白表达的影响。弓形虫感染人巨噬细胞可以经STAT3-miR17~92-Bim信号通路抑制宿主细胞凋亡。