益生乳酸菌长期连续传代过程中遗传稳定性的研究

In this project, a probiotic strain named Lactobacillus casei Zhang that was screened from lactic acid bacteria(LAB)isolated from koumiss in the minority areas of China was selected as the research object.To systematically study its genetic stability,colony apparent morphological characteristics,resistence to low pH and bile salts,adhesion ability etc during long-term continuous propagation were first assessed;whole genome re-sequencing technique was subsequently employed to further unravel its genetic stability. Combining these data together, we aim to unravel the molecular mechanism behind the variation by analyzing the evolution law. Through the research, suitable culture method for this probiotic bacterium may be established, and we anticipate to establish a set of scientific, complete identification technology and analysis platform for inspecting the genetic stability. At the same time, the implementation and finish of this project will lay a solid theoretical foundation for China's further research, development and utilization of probiotic LAB.

本项目以从我国少数民族地区自然发酵酸马奶中分离、筛选得到的一株益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang为研究对象，首先从菌落表观形态、耐酸耐胆盐特性、粘附性等多方面对L. casei Zhang在长期连续传代过程中的稳定性进行系统评价；之后，采用基于基因组重新测序的方法对其遗传稳定性进行深入剖析；最终将这些动态数据有机结合分析其进化的基本规律，以期揭示变异产生的分子遗传学机制。通过该项目的研究，拟建立适合用于该益生乳酸菌的传代培养方法，从而在基因组水平上建立一套科学、完整的检验益生乳酸菌传代过程中遗传稳定性的鉴定技术与分析平台。这一项目的实施和完成可为我国益生乳酸菌和发酵剂的进一步研究、开发和利用奠定坚实的理论基础。

本研究以从我国少数民族地区自然发酵酸马奶中分离、筛选得到的一株益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang为研究对象，按照1%接种量每24h传代一次（约为6.64代），通过分析该菌在长期连续传代过程中的表现型和基因型的变化对其稳定性进行了系统评价。这一项目的实施和完成可为我国益生乳酸菌和发酵剂的进一步研究、开发和利用奠定坚实的理论基础。.研究结果显示，在连续培养期间L. casei Zhang的细胞和菌落形态没有变化，且连续培养并不会改变培养周期内总生物量和周期末活菌数；对各种碳水化合物的代谢能力基本没有改变，且菌种活力保持良好。益生菌L. casei Zhang在常规培养基中连续培养期间生长情况持续较好，具有相对稳定的表型特征，基本没有发现衰退现象。对益生菌L. casei Zhang的基本益生特性的跟踪分析表明，L. casei Zhang对pH2.5的人工胃液以及pH8.0的人工肠液耐受能力、胆盐的耐受能力和反应益生菌粘附性的自凝集率在一定时期内均可维持稳定。利用高通量测序平台对L. casei Zhang在两种培养基中连续培养的菌株进行基因组重测序分析，共发现126处SNP突变位点和15个InDel突变位点。碳源限制性MRS培养基中发现SNP突变位点平均数量少且多数为高频突变，一旦建立即可稳定遗传，显示经历了选择压力；在一些菌株中高频率SNP突变位点增加，表明此时选择压力已经下降，出现种群分化现象。同时，在两种培养基中L. casei Zhang传代菌株中均发现在基因rpoC中出现了高频率突变，据此推测L. casei Zhang在不同培养条件下发生着一种趋同进化，高速生长的细菌占有竞争优势。.总体而言，益生菌L. casei Zhang的基因组在两种培养基中连续传代培养过程中高频突变较少，并且低频突变在后续培养过程中有消失的迹象。这一生物学现象暗示菌株已适应在这一生存环境，并可在该环境中长期生存。与此同时，我们的研究结果充分说明L. casei Zhang可在较长时期内维持稳定表型特征及益生特性，可用于产业化生产。