应用单细胞测序技术对传统乳制品中乳酸菌生物多样性的研究

This project focuses on studying the Chinese traditional dairy products. To systematically investigate the biodiversity of lactic acid bacteria (LAB), first of all, metagenomic strategy was adopted by PacBio SMRT sequencing of the full length 16S rRNA gene. On this basis, genomes of low abundance and non-cultivable microorganisms can be further deciphered using Raman-based single cell sequencing technology, with a view to reveal the entire biodiversity of LAB in the traditional dairy products at the species level. The outcome of this study also provides a theoretical basis for the quality improvement and industrial production of the traditional dairy products. Meanwhile, we hope to establish a set of analysis platform, based on the single cell sequencing technology, which can determine the LAB population structure quickly and accurately. Since there is no previous research on LAB by using the single cell sequencing technology, the implementation and the completion of this project will bring new discoveries for the research field of LAB, which will at the same time create new opportunities for human to use these important and beneficial microbial resources.

本课题拟以中国传统乳制品为研究对象，首先采用宏基因组研究策略结合PacBio SMRT测序技术，以16S rRNA全长为测序靶点对乳酸菌生物多样性进行系统普查。在此基础上，进一步运用基于拉曼分选方法的单细胞测序技术破译低丰度及不可培养乳酸菌的基因组，以期在“种”水平“全景式”的揭示我国传统乳制品中的乳酸菌生物多样性，最终为传统乳制品的品质改良和工业化生产提供理论依据。与此同时，建立起一整套基于单细胞测序技术，可快速、准确揭示乳酸菌种群结构的定性分析系统。鉴于国内外尚未见利用单细胞测序技术对乳酸菌进行研究的报道，该项目的实施和完成有望给乳酸菌研究领域带来全新的发现，也将为人类利用其中的重要有益微生物资源创造更多新的机遇。

本研究将酸马奶样品稀释获得30份单细胞悬液，用于单细胞全基因组扩增。采用Illumina测序技术对酸马奶样品进行分析，共鉴定出24种细菌，除酸马奶中常见的优势细菌，如Lactobacillus helveticus、Lactococcus lactis、Lactobacillus kefiranofaciens、Streptococcus parauberis和Enterococcus faecium外；还鉴定出5个低丰度物种，包括Lactobacillus otakiensis、Streptococcus macedonicus、Ruminococcus torques等。采用PacBio单分子实时测序技术进一步分析酸马奶单细胞悬液，共鉴定出62种细菌。与采用Illumina测序技术获得的细菌种相比，PacBio SMRT鉴定出的物种数量提高约2.58倍。除常见物种外，还发现另外6种低丰度的乳酸菌物种，分别为Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus parabuchneri、Leuconostoc citreum、Lactobacillus sunkii和Lactobacillus hamsteri。.酸马奶中除检测到乳酸菌和醋酸菌等常见细菌外，还检测到微量的病原菌（如：Klebsiella pneumonia）以及其他具有生物学应用潜力的物种（如：Macrococcus caseolyticus）。这些研究结果不仅有利于全面了解酸马奶中的细菌组成，而且为发酵乳生产过程中的细菌污染检测提供了新的方法。.为深入了解酸马奶中细菌编码的基因功能，对其进行京都基因与基因组百科全书数据库、蛋白质直系同源簇数据库和碳水化合物活性酶数据库注释分析，结果表明酸马奶中细菌编码丰富的氨基酸转运和代谢及碳水化合物转运和代谢基因，特别是含有大量的乳糖代谢基因，这些基因对酸马奶中细菌的生长繁殖及其特有风味的形成具有重要意义。此外，酸马奶中细菌还编码大量的糖苷水解酶和糖苷转移酶基因，这些碳水化合物活性酶具有重要的生物学应用潜力。.单细胞扩增技术与宏基因组方法结合的研究手段能够快速、精准的揭示传统发酵乳中的细菌构成，为传统发酵乳中微生物多样性及功能基因研究提供了新的思路。