益生乳酸菌适应抗生素环境过程中潜在进化分子机制的研究

Antibiotic resistance has long been a hot issue in the field of food microbiology. In this project, the development of antibiotic tolerance in the probiotc lactic acid bacteria Lactobacillus casei Zhang will be employed as a laboratory evolution model. We will combine whole-genome re-sequencing technique and phenotypic tests to simultaneously trace the changes of phenotypes and genotypes. By doing this, we hope that the molecular mechanisms behind the adaptation to the antibiotic environment will be fully elucidated. Through the research of the project, it is expected to establish a method for safety evaluation of antibiotic resistance based on target genes. Meanwhile, the implementation and completion of the project will lay a solid theoretical foundation for the further research, development and utilization of probiotic lactic acid bacteria and fermentation agent, which has important practical significance.

抗生素抗性长期以来一直都是食品微生物学领域关注的热点问题。本课题以益生乳酸菌L. casei Zhang抗生素耐受性实验室进化过程为研究模型，通过结合基因组重测序技术同时观测表型和基因型变化，以期全面揭示L. casei Zhang适应抗生素环境过程中的潜在分子机制。通过该项目的研究，有望突破建立基于抗生素抗性靶向基因的安全性评价方法。与此同时，这一项目实施和完成可为我国益生乳酸菌和发酵剂的进一步研究、开发和利用奠定坚实的理论基础，具有重要的实际指导意义。

本项目以益生菌干酪乳杆菌Zhang为研究对象，采用实验室进化的研究方法将其接种至含有恒定浓度的单一阿莫西林或庆大霉素及2者混合的LSM培养基中连续传代2000代，每隔200代取样进行基因组重测序，同时测定其耐药性、活菌数和OD值的变化以分析其在传代过程中表型和基因型的变化。研究阿莫西林和庆大霉素对干酪乳杆菌Zhang的作用机制以及其对该2种抗生素耐药性增加的机理。.经研究发现，在含有单一阿莫西林或庆大霉素及2者混合的LSM培养基中连续传代的菌株耐药性缓慢增加并分别在600、1200和1200代时开始保持恒定。.通过对各代数不同培养基传代的干酪乳杆菌Zhang的3个谱系基因突变(SNPs，InDels和SV)的检测，发现阿莫西林和庆大霉素分别对干酪乳杆菌Zhang细胞壁合成与细胞的转录和翻译有较大的影响。在LSM-A中传代的菌株形态呈现长的细丝状，且LSM-A中传代菌株中检测出与较大分子量青霉素结合蛋白相关的基因mrcA，pbpA，pbpB发生了突变。青霉素结合蛋白与细菌形态有直接联系，并对细菌生长和繁殖有重要影响。LSM-A中传代的3个谱系活菌数始终保持相对较低的水平，而LSM-G中传代的干酪乳杆菌Zhang则随着传代的进行，活菌数和OD值都与对照菌株逐渐接近，说明不同抗生素对干酪乳杆菌Zhang的作用机制不同，使其在进化过程中出现不同的适应性。.基因组重测序分析显示，在不同培养基传代的各代干酪乳杆菌Zhang基因组中检测出抗生素钝化酶、细胞膜转运蛋白、修复蛋白和信号转导等与抗生素耐药性相关的基因突变，这些基因突变对干酪乳杆菌Zhang改变抗生素作用靶位点、转运并外排抗生素、改变细胞膜通透性、钝化和改变抗生素结构、调控抗药基因的表达并维持正常能量代谢有重要的作用。与其耐药性增强的直接或间接相关的基因突变均未发生在转座区域或者质粒中，干酪乳杆菌Zhang是一株安全的益生菌。