NF-кB p65活化在调控细菌脂蛋白耐受巨噬细胞杀菌能力中的作用及其相关分子机制

Tolerance to bacterial cell-wall components including gram-positive bacterial lipoprotein (BLP) , which characterized by a reduction in the release of inflammatory mediators and enhanced resistance to infection, represents an essential protective regulation forming in the long-term process of evolution. However, the underlying mechanisms remain unclear. Our previous work has demonstrated that a microbial challenge to BLP-tolerised macrophages led to an inhibition of p38 activation as well as an increasing phosphorylation and translocation into the nucleus of p65; while blocking the NF-кB pathway resulted in a significantly reduction of antibacterial activity. To further confirm the regulatory role of NF-кB p65 activation involved in the bactericidal effect of BLP-tolerised macrophages and explore its related molecular mechanisms, chromatin immunoprecipitation (ChIP) combined with PCR array and proteomics, RNAi, molecular cloning and other molecular biology methods will be used and some new target genes regulated by NF-кB pathway and cofactors of p65 will be identified. The results will give us a new insight into the molecular mechanisms of BLP tolerance and provide a theoretical basis for the prevention and treatment of septic shock.

对细菌细胞壁成分细菌脂蛋白(BLP)的耐受是生物在长期进化过程中形成的一种保护性调节机制，是机体防御反应的重要组成部分。其特征是促炎介质的释放减少而抗感染能力增强。目前对此机制尚不清楚。我们前期的研究发现，BLP耐受的巨噬细胞再次感染细菌后其p38激活受到抑制，而p65磷酸化增强并移位入核；抑制NF-кB通路的激活可以显著降低BLP耐受细胞的杀菌活性。为了进一步证实BLP耐受巨噬细胞杀菌活性的增强有赖于NF-кB通路激活，阐明p65活化在调控细菌脂蛋白耐受细胞杀菌作用中的机制，本课题拟采用RNA干扰、分子克隆等分子生物学手段从多角度探索NF-кB在调控细菌脂蛋白耐受细胞杀菌能力中的作用；用染色质免疫沉淀技术(ChIP)结合PCR芯片、蛋白质组学技术鉴定NF-кB活化调控的靶基因以及调控这些靶基因的共激活子和调控因子，为阐明BLP耐受的分子机制、临床防治脓毒性休克提供新的作用靶点和理论依据。

对细菌细胞壁成分的耐受是细菌感染过程中细胞或机体对入侵病原菌的一种重要防御机制。细菌脂蛋白（Bacterial lipoprotein，BLP）诱导的耐受可通过减弱炎症反应并增强杀菌活性减轻脓毒症对机体造成的损害。以往的研究表明BLP耐受可通过抑制TLR2信号通路从而减少促炎细胞因子的释放；但是，关于BLP耐受所介导的杀菌活性增强的信号通路和/或分子机制尚不清楚。本研究表明BLP耐受的巨噬细胞在受到革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌刺激时与非耐受的巨噬细胞相比，可表现为吞噬体成熟加速，以及杀菌活性增强等，这一作用可能是通过上调Acp5和Rab10来介导的，而Rab10和Acp5是在BLP耐受巨噬细胞增强的杀菌活性中起着重要作用的两个膜转运调节因子和溶酶体酶。本研究尤其值得关注的是BLP耐受的巨噬细胞在受到细菌刺激时会明显增强IkBa和NF-kB p65的磷酸化，以及p65的移位入核，提示细菌刺激BLP耐受巨噬细胞时激活了NF-kB信号通路。NF-kB信号通路的激活对于BLP耐受巨噬细胞增强的杀菌活性是至关重要的，因为如果抑制BLP耐受巨噬细胞NF-kB信号通路的激活，将会显著减弱BLP耐受巨噬细胞受到金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌刺激时增强的吞噬体溶酶体融合以及杀菌活性，并明显减少鼠伤寒沙门氏菌诱导的Acp5以及Rab10的表达。与TLR信号通路相似，胞浆识别受体NOD1和NOD2也是通过识别细菌配体激活NF-kB转录因子信号通路来启动靶基因转录的。我们发现下调NOD1和NOD2能显著减弱BLP耐受巨噬细胞受到细菌感染时诱导的NF-kB信号通路的激活，以及Rab10和Acp5的表达，这些结果更有力地证明了NOD1和NOD2信号通路参与了BLP耐受巨噬细胞细菌刺激后诱导的NF-kB信号通路的激活以及随后杀菌活性增强的过程。因此，这些结果提示，NF-kB信号通路的激活对于BLP耐受吞噬细胞介导的杀菌活性增强至关重要，而这一作用可能同时依赖于NOD1和NOD2信号通路的激活。