基于CRISPR/Cas9研究高羊茅转录“记忆”基因FaHSP17.8-CII调控耐高温的分子作用机制

High-temperature is considered as the major factor limiting cool-season turfgrass tall fescue. In previous study, we identified some genes performing transcriptional memory in response to high-temperature stress from tall fescue RNA-seq data. Transcriptional memory gene FaHSP17.8-CII, which demonstrated by an elevated transcript level during one or more subsequent stresses relative to the initial stress, and return to their initial (non-stressed) transcript levels during the recovery states. In addition, the transcript level of these genes is related with the target A class heat shock transcription factor (FaHsfA) and histone methylation. Based on these previous researches, our present research will focus on: 1) identifying the FaHsfA and histone methylation of transcriptional memory genes; 2) verifying the histone methylation pattern of transcriptional memory genes and heat resistant traits in tall fescue by FaHsfA over-expression or CRISPR mutant. The objectives of this study are: 1) to understand the molecular mechanisms of FaHSP17.8-CII in tall fescue in response to heat stress and the regulation of histone methylation; 2) to provide novel scientific basis for improving high-temperature resistance using gene editing technique in cool-season turfgrass.

高温是限制冷季型草坪草高羊茅推广应用的主要因素。前期研究中，我们从高羊茅转录组数据库中筛选出，一个细胞质ClassII小分子热激蛋白基因FaHSP17.8-CII具有转录记忆效应，并发现5个A类热激转录因子（FaHsfA）与该基因诱导表达正相关，而在模式植物上已证实基因转录“记忆”受组蛋白甲基化调控。在此基础上，本项目拟通过以下研究进一步阐明FaHSP17.8-CII在高羊茅耐高温胁迫中的分子机理：①鉴定调控FaHSP17.8-CII的上游FaHsfA和组蛋白甲基化修饰模式；②FaHSP17.8-CII和FaHsfA超表达和CRISPR突变后，分析FaHSP17.8-CII组蛋白甲基化修饰水平和转录记忆强弱变化，及植株抗热表现。本项目的成功实施不仅将深化对高羊茅转录记忆效应基因调控耐高温分子机制的理解，也将为基于基因编辑技术培育耐高温冷季型草坪草搭建重要平台。

高羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）是我国使用量增长最快的草坪草，在我国北部及长江流域气候过渡区广泛建植应用。高温是限制冷季型草坪草高羊茅推广应用的主要因素。基因编辑技术已被广泛运用于水稻、小麦等农作物种质创新，而异源六倍体高羊茅未见相关报道。要利用基因编辑技术进行抗高温高羊茅种质创新，需要有高效的遗传转化体系。本研究，通过筛选高羊茅不同基因型优化组培体系，构建了高羊茅高效遗传转化体系，并在异源六倍体高羊茅中CRISPR-Cas9/Cas12a基因编辑体系。利用此体系编辑获得的T0代植株具有表型，这对于异源六倍体高羊茅种质创新意义重大。我们构建了热激记忆基因FaHSP17.8-CII的超表达和CRISPR突变体植株。对转基因材料热驯化性状分析，发现FaHSP17.8-CII主要是通过降低ROS富集水平和增强叶绿体PSII活性提高植株抗高温能力，并提出了热激记忆基因增强植株抗高温能力的FaHSP17.8-CII-PSII-ROS调控模块。通过CHIP分析，明确了高羊茅高温逆境“记忆”基因表观学Marker物质H3K4me3。另外，热激记忆基因FaHSP17.8-CII超表达后植株抗镉和铅能力增强，地下部向地上部重金属转移能力及地上重金属富集能力增强，说明FaHSP17.8-CII也可以用于植物重金属修复。此外，在本项目的资助下，通过miRNA，RNA-Seq和GC-MS组学数据鉴定10余条与抗高温和分蘖相关的pathway，这为今后高羊茅种质创新提供重要基因资源。