聚乙二醇修饰血红蛋白四聚体的稳定性研究

聚乙二醇(PEG)修饰的血红蛋白能有效地扩容和载氧,可作为一种潜在的血液代用品。然而,PEG修饰会导致血红蛋白四聚体解聚为二聚体，破坏了血红蛋白的结构与功能特性。由于提高Val-1(alpha)位点的疏水性能增强血红蛋白四聚体的稳定性，因此本课题提出将小分子特异性修饰和PEG特异性修饰结合起来，用于提高PEG修饰血红蛋白四聚体的稳定性。首先在人血红蛋白的Val-1(alpha)位点上分别特异性地引入丙基和对甲苯丙基，随后在血红蛋白的Val-1(beta)或Cys-93(beta)位点上进行特异性的PEG修饰。优化化学修饰反应过程，并用离子交换层析介质分离纯化修饰蛋白。这种结合的化学修饰方法预期能提高PEG修饰血红蛋白的四聚体稳定性，并且能改善PEG修饰血红蛋白的结构与功能特性。这一结果对于设计新型的PEG修饰血红蛋白具有指导意义，并为后续开发新型的PEG修饰药用蛋白和多肽类药物奠定基础。

聚乙二醇（PEG）修饰的血红蛋白可作为一种潜在的血液代用品。然而，PEG修饰会降低血红蛋白的四聚体稳定性，破坏了血红蛋白的结构与功能特性。本项目从人红细胞的破碎液中分离纯化血红蛋白，蛋白纯度达到电泳纯。通过化学修饰和分离纯化，制备出了在Val-1(α)上特异性丙基化的血红蛋白（Pr-Hb）和对甲苯丙基化的血红蛋白（PrB-Hb）。通过PEG-马来酰亚胺修饰，制备出了在Cys-93(β)上PEG特异性修饰的血红蛋白（PEG-Hb1）、Pr-Hb（PEG-Pr-Hb1）和PrB-Hb（PEG-PrB-Hb1）。通过PEG-醛修饰，制备出了在Val-1(β)上PEG特异性修饰的血红蛋白（PEG-Hb2）、Pr-Hb（PEG-Pr-Hb2）和PrB-Hb（PEG-PrB-Hb2）。凝胶过滤、SDS-PAGE和反相HPLC证明了这6种PEG修饰产物的高纯度，胰蛋白酶切图谱确定了这6种修饰产物中PEG修饰位点的专一性。在血红蛋白的Val-1(α)上特异性地引入丙基后，可提高血红蛋白和PEG修饰血红蛋白（PEG-Hb1和PEG-Hb2）的四聚体稳定性。引入对甲苯丙基可进一步提高其四聚体稳定性，其中PEG-PrB-Hb1和PEG-PrB-Hb2的四聚体稳定性甚至高于未修饰的血红蛋白。圆二色光谱分析结果表明，对Val-1(α)进行丙基化和甲苯丙基化能减弱PEG修饰对血红素微环境结构的干扰。内源前表面荧光光谱分析结果表明，与丙基化相比，对Val-1(α)进行甲苯丙基化能更有效降低PEG修饰对血红蛋白α1β2界面结构的干扰，有利于维持血红蛋白的四级结构。此外，甲苯丙基化比甲基化能更有效降低PEG修饰血红蛋白的自氧化速率，同时提高血红素的稳定性。丙基化和甲苯丙基化虽然能在一定程度上影响PEG-Hb的氧释放，但不会影响其亚基间的协同性（即Hill效应）。小动物体内的微循环实验表明，PEG修饰能够避免血红蛋白导致的血管收缩，丙基化和甲苯丙基化仍然保持这一特性。因此，通过对Val-1(α)进行甲苯丙基化，能提高PEG修饰血红蛋白的四聚体稳定性，改善其结构与功能特性。这一结果对于设计新型的PEG修饰血红蛋白具有指导意义。