衣藻miRNA效应复合体生化与功能分析

miRNA是一种长21－25碱基的单链小RNA，它能通过切割靶mRNA或者抑制靶mRNA转录来调控基因的活动，在生长和发育调节过程中起重要作用。我们前期的研究表明miRNA不仅存在于多细胞的生物物种内，在原始的单细胞生物衣藻中也同样存在着 miRNA的调控机制。本研究在此基础上期望通过对衣藻中Argonaute蛋白和miRNA形成的效应复合体的生化特性与功能进行深入细致的研究，结合遗传学分析，进一步了解衣藻中miRNA途径的作用机制和miRNA的功能。为研究RNAi产生机理和miRNA进化过程提供的实验依据。

miRNA是一种长21~25个碱基的单链小 RNA，它们能通过切割靶mRNA或者抑制靶mRNA转录来调控基因的活动。在单细胞莱茵衣藻中发现miRNA不仅是对 “miRNAs只存在于多细胞生物中”教条认识的颠覆而且为蓬勃发展的小RNA研究提供了重要信息。本课题截至目前为止已经完成了衣藻中三个Agonaute基因的克隆和表达载体的构建，完成衣藻的转化，获得了稳定的转基因株系,并完成AGO蛋白复合体的纯化与生化分析。生化分析表明AGO3具有切割活性，而AGO1则没有。通过高通量sRNA测序分析，衣藻中AGO3结合的sRNA具有很强的5‘ U的偏好性，且结合已知的miRNA，由此推断AGO3在miRNA途径中起着主导作用。.衣藻在缺氮的条件下可以产生配子体进行有性生殖过程。我们之前的研究表明在衣藻配子体分化过程中，一些miRNAs的表达模式发生了改变，说明它们可能在调节有性生殖的过程中发挥了作用。为了解营养生长期、配子期、合子期小RNA的表达情况，我收集克隆不同时期的RNA材料，并进行了高通量测序。生物信息学分析表明: 营养生长期、配子期、合子期小RNA 5’端第一个碱基以A、U的为主，占到总数的60%以上。同时我们也发现在营养生长期、配子期、合子期中miRNA与反向重复来源的小RNA呈现比例逐步增大的趋势。同时通过转化可诱导衣藻形成合子的GSP1基因，发现合子体特异表达miRNA的生成受到GSP1基因的调控。我们进一步分析了AGO1和AGO3在营养生长期、配子期、合子期结合的miRNA，发现衣藻中AGO3特异性的结合合子中特异表达的miRNA，在有性生殖过程中，miRNA通过AGO3行使功能。