绵羊甘露聚糖结合凝集素基因与支原体肺炎的相关性研究

甘露(聚)糖结合凝集素(Mannan-binding lectin，MBL)是一种存在于血清中的C型凝集素，通过补体系统以及其它抗感染途径，在机体免疫中起着重要的作用，对MBL基因的研究可以提供一条治疗传染性疾病的新途径。本研究以绵羊为实验对象，以目前在新疆绵羊中爆发的支原体肺炎为疾病模型，从绵羊MBL基因入手，通过TAIL-PCR、ELISA检测、PCR-SSCP、MS-PCR、群体人工感染、定量RT-PCR等研究手段，旨在克隆绵羊MBL基因，检测MBL血浆蛋白水平，分析该基因的多态性及其启动子甲基化水平与MBL蛋白表达的关系，验证它们在抗支原体感染中起到的作用。以期从基因序列、表观修饰、蛋白表达、外源调控、实际抗病等多个角度去揭示MBL在抗感染中所起到的作用，确定MBL基因与实际感染间的相关性。为进一步应用于绵羊支原体肺炎治疗，抗病选育提供有效依据。

甘露(聚)糖结合凝集素(Mannan-binding lectin，MBL)由肝脏合成，是一种存在于血清中的C型凝集素。本课题以其为主要研究对象，针对在新疆地区广泛传播的绵羊支原体肺炎设计了相关实验内容，取得了以下研究成果：.1. 采用分段克隆的策略完成了绵羊MBL基因的克隆，利用TAIL-PCR技术克隆获得其679 bp 5’侧翼序列，证实该基因含外显子4个，内含子3个，编码218个氨基酸。并通过在线预测网站对其结构进行了分析,获得序列信息已经提交NCBI（ID：FJ977629）。.2. 采用Elisa检测技术分析了MBL表达水平和MP抗体水平的关系，以此为依据，建立实验用绵羊群体。PCR-SSCP分析结果显示：绵羊外显子Ⅰ存在四种基因型和支原体感染率相关，分别是AA、BB、CC和BC型，其中CC型表现为抗性型。重亚硫酸氢盐测序法(BSP)结果显示：在患绵羊支原体肺炎组中MBL基因启动子区更易发生甲基化，且MBL基因中启动子区靠近编码序列的CpG位点甲基化可能对于调控MBL蛋白表达具有更为重要的意义。.3. 以湖羊、德国美利奴羊及中国美利奴羊为研究对象，采用PCR-SSCP检测发现：德国美利奴羊、中国美利奴羊和湖羊等不同品种的外显子1存在明显差异，其中德国美利奴羊和中国美利奴羊之间差异较小，其与湖羊相比差异较大。.4. 从中国美利奴羊群中选择1150只羔羊进行MBL基因多态分析，选择不同基因型羔羊42只（约二月龄）进行人工接种感染，荧光定量PCR技术结果显示：不同MBL基因型绵羊攻毒感染后血清MBL浓度呈下降趋势，MBL 基因CC、BC型其MBL、IFN-γ、C3浓度较高；而MBL 基因AA、BB型其IL-2、IL-4、TNF-α、C1浓度升高显著，随炎症的舒缓，逐渐降低，提示上述免疫因子水平的变化可能与病情轻重有关。. 以上研究成果最终提示：绵羊MBL基因功能区及启动子区不同基因型同支原体肺炎感染抗性存在关联，并与IFN-γ、C3等免疫因子有关。课题组至2013年1月止，共发表论文5篇，其中SCI收录1篇，申请专利2项，在投论文4篇，培养博士研究生1名，硕士研究生2名，达到了预期目标。