不同抗性基因型绵羊甘露聚糖结合凝集素（MBL）抗支原体肺炎抗病机理研究

The Mannan-binding lectin(MBL) plays an important role in body immune. The previous study indicated that MBL protein expression levels are always different within different genotypes，and the MP resistance is different. The recombinant MBL has been used in human beings ,but the mechanism of MBL protein on anti-mycoplasma pneumonia is unclear so far, it is uncertain to develop and utilize sheep MBL. In this study, based on MBL gene and pneumonia mycoplasma used as disease model,a eukaryotic expression system which expresses MBL will be constructed. Changes of antibodies and immune factors in sheep of different genotypes after exogenous injection of the MBL expression vector, artificial infection of the bronchial mucosa cells or alveolar epithelial cells with pneumonia mycoplasma will be measured. Cellular mechanisms of mycoplasma infection will be investigated. In order to look into gene expression changes caused by genotype difference of MBL, gene chip technology and miRNA sequencing will be used in this research. These results will be used to analysis the molecular regular mechanism of MBL as the primary resistant infectious factor. The study will establish a theoretical basis to explore and utilize MBL gene.

甘露(聚)糖结合凝集素(Mannan-binding lectin，MBL)在机体免疫中起重要作用。项目组的前期研究表明，不同MBL基因型绵羊血浆中MBL蛋白表达水平不同，对MP的抗性也不同。在人类中已有利用重组MBL蛋白治疗支原体肺炎的案例，但到目前为止MBL蛋白抗肺炎支原体作用方式及机理仍然还不清楚，这就给开发利用绵羊MBL基因带来了不确定因素。本研究拟从MBL基因入手，以绵羊肺炎支原体为疾病模型，构建MBL真核表达载体，体外表达MBL蛋白，通过外源注入的方法，检测注入后具有不同抗性基因型绵羊体内相关抗体及免疫因子变化，同时利用绵羊支气管粘膜细胞或肺泡上皮细胞作为细胞模型，体外研究绵羊肺炎支原体侵染细胞的抗性机制；采用转录组测序技术和miRNA测序技术，分析MBL不同基因型引发的多基因表达谱变化；以上研究结果综合分析MBL作为一线抗感染因子的分子调控机制，为利用MBL基因提供依据。

甘露(聚)糖结合凝集素(Mannan-binding lectin，MBL)由肝脏合成，是一种存在于血清中的C型凝集素。本课题以其为主要研究对象，针对在新疆地区广泛传播的绵羊支原体肺炎设计了相关实验内容，取得了以下研究成果：.1. 采用PCR获得长约750bp的绵羊MBL基因cDNA片段，将其定向插入真核表达载体中，构建重组真核表达载体pUC57-MBL，经过蛋白表达与鉴定及纯化后，获得重组MBL蛋白，根据已有报道的人类MBL纯化方法分离纯化绵羊天然MBL蛋白。.2. 采用Elisa检测技术分析了MBL表达水平和MP抗体水平的关系，以此为依据，建立抗MP的不同MBL基因型羊群和对照易感MP的不同MBL基因型羊群。qRT-PCR分析结果显示：注射MBL蛋白后患病机体MBL、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、C1和C3表达水平均有不同程度的升高，随后逐渐降低，说明随着病程的发展，炎症有所舒缓。.3. 蛋白注射四周后对抗病组和易感组患病绵羊屠宰取样，采集肝脏组织，送生物公司进行miRNA HiSeq高通量测序及转录组测序，利用生物信息学方法筛选得到差异显著的基因，最终采用双荧光素酶报告系统验证筛选miRNA-509-5p的靶基因为TRAF6，转染至呼吸道粘膜上皮细胞中，验证靶基因功能。.4. 体外构建绵羊呼吸道黏膜上皮细胞与绵羊肺炎支原体共培养模型，RT-PCR 测定感染不同时间段筛选获得的差异基因 mRNA 表达量和酶联免疫吸附试验（ELISA）测定上清中 MBL 及各细胞因子变化，激光共聚焦和凋亡实验结果表明绵羊肺炎支原体能够促进呼吸道黏膜上皮细胞凋亡，而重组MBL蛋白具有一定的保护作用。.以上研究成果最终提示：不同抗性基因型绵羊甘露聚糖结合凝集素与绵羊支原体肺炎感染抗性存在关联，重组MBL蛋白在绵羊支原体肺炎发病中具有一定的保护作用。课题组至2018年12月止，共发表论文7篇，其中SCI收录1篇，在投论文2篇，培养硕士研究生4名，达到了预期目标。