TRIM33在表观遗传水平上对TGF-β信号通路的调控

The transforming growth factor (TGF-β)family plays major roles in embryo development, tissue homeostasis, adult immunity, and wound repair. Regulation of gene expression is central to all these effects. We have reported that TGF-β signals use the poised histone mark H3K9me3 to trigger differentiation of murine embryonic stem cells through TRIM33-Smad2/3. Nodal receptors induce the formation of companion Smad4-Smad2/3 and TRIM33-Smad2/3 complexes. TRIM33-Smad2/3 binds the histone marks H3K9me3 and K18ac on the promoters of mesendoderm regulators Gsc and Mixl1. Binding is through the PHD-Bromo cassette of TRIM33.But, how the signal pathway is regulated through TRIM33-Smad2/3 epigenetically, how Smads gain access to master differentiation genes in stem cells, and how these processes are disrupted in cancer remain poorly understood. In this proposed study, I will identify the entire set of target genes of TRIM33-Smad2/3 in differentiated mesendoderm cells and its potential regulatory elements in the genome. By identifying co-factors that associate with TRIM33 I will elucidate the mechanism by which TRIM33-Smad2/3 epigenetically promote mesendoderm differentiation. In addition, I will investigate how TRIM33 helps the cooperation between TGF-β and Wnt pathways during mesendoderm differentiation.

TGF-β超家族在胚胎发育，组织稳态，成体免疫及伤口修复中起着中心调控作用。信号通路调控的核心是基因转录调控。TRIM33是TGF-β通路中调控基因转录的关键成员。研究表明，在早期小鼠胚胎干细胞中，TGF-β信号通路通过TRIM33-Smad2/3利用待激发的组蛋白标记H3K9me3来调控中内胚层调节子Gsc和Mixl1的表达，以此来诱导分化。但是，在表观遗传水平上TGF-β通过TRIM33-Smad2/3进行分化调控的具体机制及全基因组范围内的靶基因和调控位点，及在癌细胞内这些调控是如何中断的都未获得十分清楚的的解析。我们将鉴定存在于中内胚层已分化细胞内的TRIM33-Smad2/3的全部靶基因及基因组内潜在的调节性元件。通过鉴定和TRIM33作用的辅因子，阐明TRIM33-Smad2/3全局性促进中内胚层分化的机制，从而加深对TGF-β相关疾病特别是肿瘤和发育系统疾病的理解。

转化生长因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）信号在组织稳态调节、免疫反应、胚胎发育和肿瘤的发生中都发挥着重要功能。在人和小鼠早期胚胎发育过程中，TGF-β信号可以促进中内胚层分化。TRIM33是TGF-β通路在表观遗传水平上调控与早期分化有关基因转录的关键成员，在小鼠胚胎干细胞的分化过程中具有重要调控功能。然而在表观遗传水平上TGF-β通过TRIM33-Smad2/3进行分化调控的具体机制及全基因组范围内的靶基因和调控模式，以及癌细胞内这些调控如何中断，目前还未获得十分清楚的解析。.本课题首先分析了小鼠胚胎干细胞状态和分化状态下转录因子蛋白TRIM33、Smad2/3的测序数据，发现TRIM33和Smad2/3在分化状态共同结合在中内胚层分化基因（Mixl1、Gsc等）启动子区。进一步分析发现组蛋白修饰H3K18ac、H3K27ac和转录因子TRIM33、Smad2/3响应TGF-β信号共同结合在染色质开放区，诱导分化基因表达。接着为了解释TRIM33影响染色质活性和分化基因转录的具体机制，我们运用亲和层析及质谱发现TRIM33跟乙酰化相关蛋白HDAC1、p300结合。通过乙酰化抑制剂和敲低实验发现，HDAC1（而不是HDAC2）抑制，而p300（不是CBP）能促进小鼠胚胎干细胞分化。进一步的生化实验表明，敲低HDAC1能增强TRIM33和Smad2/3结合到分化基因Mixl1、Gsc启动子的能力，从而增强分化基因响应TGF-β信号的能力，促进分化；而p300能维持H3K18ac、H3K27ac的水平，而且能依赖于TGF-β信号跟TRIM33相互作用，并结合到分化基因启动子区；当敲除TRIM33时，p300结合到分化基因启动子区的能力明显减弱，表明p300在促进分化的功能中呈现正反馈机制。另一方面，本项目发现在小鼠胚胎干细胞中TRIM33能和β-catenin相互作用，并且不依赖于Ring结构域的E3泛素连接酶活性，调控Wnt靶基因的表达，这表明TRIM33蛋白发挥功能具有细胞类型特异性。.综上所述，本课题解释了TRIM33协同TGF-β信号通路，在染色质活性和基因转录调控水平调节小鼠胚胎干细胞分化的机制，对于我们理解胚胎发育进程、研究胚胎分化的表观遗传调控提供了理论借鉴。