周期性饥饿胁迫对重组大肠杆菌高密度培养的影响机理

本项目将系统研究周期性饥饿胁迫（种类、强度、持续时间及引入阶段）对类人胶原蛋白基因工程菌高密度培养过程的影响，考察周期性饥饿胁迫下发酵过程中细胞生长（细胞干重）、类人胶原蛋白表达、主要代谢副产物的产生、细胞的呼吸参数（菌体摄氧量，呼吸强度，二氧化碳释放率，呼吸商）及热动力学参数；测定周期性饥饿胁迫下应激反应的全局性调控因子,从而从应激反应的角度，解释周期性饥饿胁迫对发酵过程的影响；分析建立高密度培养条件下环境条件、应激反应、细胞呼吸、热动力学参数及宏观代谢的相互关系。本研究实验结果可直接用于指导类人胶原蛋白发酵过程的控制与放大，并为重组大肠杆菌其他生产体系的过程优化和控制提供参考。有关理论成果可以补充现有的关于高细胞密度下大肠杆菌饥饿胁迫及其引发应激反应的理论体系，为大肠杆菌的代谢工程改造和重组蛋白表达体系设计提供理论基础。

本项目研究了葡萄糖饥饿胁迫和酵母粉饥饿胁迫对重组大肠杆菌耐热性和高密度发酵过程细胞生长的影响，并采用脉冲补料技术，通过控制脉冲补料种类、强度、持续时间及作用阶段，引入不同类型的营养胁迫，考察了菌体生长和目标蛋白表达情况；利用高效液相法测定了严紧反应调控因子表达情况；结合质谱分析仪分析了脉冲补料下氧气摄取率（OUR），二氧化碳释放率（CER）和呼吸熵（RQ）的变化趋势；对类人胶原蛋白大肠杆菌在脉冲补料下不同阶段质粒稳定性进行研究；构建了过程动力学模型和热动力学模型；考察了基于脉冲补料条件下的恒溶氧脉冲补料和阶段脉冲补料对细胞生长及类人胶原蛋白（HLC）表达的影响。研究结果：1）酵母粉饥饿对发酵过程影响较大，尤其是导致乙酸的大量积累及细胞密度的迅速下降，葡萄糖饥饿影响较小。在诱导前，进行葡萄糖饥饿应激，明显增加了细胞在高温诱导过程中的适应性，诱导后细胞生长迅速。但饥饿时间过长，应激蛋白过多会影响目标蛋白的表达，而且在诱导一段时间后，其对细胞生长造成的影响也会显示为过早老化自溶，细胞密度降低。经实验确定，饥饿0.5h对诱导过程的细胞生长和产物表达有促进作用；2）一定模式的脉冲补料可有效提高类人胶原蛋白产量。在脉冲补料过程中，细胞能利用乙酸作为碳源，减小了乙酸对细胞的毒性，此外，脉冲补料使质粒的稳定性得到了相应的提高，更好的实现高密度高表达；3）获得了可直接用于类人胶原蛋白规模生产的脉冲补料模式：当诱导前补料采用补料5.6ml/188s，诱导后采用每2.1ml/27s条件下，细胞干重和蛋白浓度达到最大，分别为75.46 g/L和7.26 g/L。4）严紧反应信号分子ppGpp浓度水平随着饥饿胁迫周期快速变化，在脉冲补料饥饿期其浓度迅速升高，随着补料进行，其浓度下降。表明脉冲补料引发细胞应激反应。5）脉冲补料发酵结束后碳回收率达到90%，该结果表明脉冲补料模式下基质还是主要流向生物量的形成。