重组大肠杆菌高密度发酵过程中ptsG对碳氮代谢的作用机理

在类人胶原蛋白的分批-补料发酵过程中，利用代谢流分析技术（MLF）优化类人胶原蛋白基因工程菌的代谢调控时，发现发酵液中葡萄糖的浓度及有机氮源的浓度是影响类人胶原蛋白产量的关键因素，且碳源在重组大肠杆菌中心代谢途径的分布量直接与氮源的浓度相关。由ptsG基因编码的酶IICBGlc对葡萄糖的跨膜转运起重要作用，但ptsG对大肠杆菌高密度发酵过程中吸收利用葡萄糖和有机氮源的调节机制还不清楚。.本研究拟在恒化培养和分批-补料培养模式下，分析ptsG在不同培养条件下对类人胶原蛋白基因工程菌的葡萄糖代谢途径及其代谢流分布的影响，并探索ptsG与有机氮源代谢及类人胶原蛋白合成间的相互作用机理，进而建立类人胶原蛋白高效表达的发酵调控模型。.该研究的成果一方面可直接用于类人胶原蛋白生产；另一方面，研究大肠杆菌的PTS代谢调控机理、氮代谢规律具有共性，可为其他重组蛋白的高效表达提供理论和方法指导。

在分批-补料发酵过程中，发酵液中葡萄糖和有机氮源对重组大肠杆菌的生长及最终的生物量、类人胶原蛋白产量的影响十分显著。ptsG编码的酶IICBGlc对葡萄糖的跨膜转运起重要作用，但ptsG对大肠杆菌高密度发酵过程中吸收利用葡萄糖和有机氮源的调节机制还不清楚，本项目旨在阐明这一问题。.本课题组成功地构建了ptsG-类人胶原蛋白基因工程菌，并分析了ptsG在不同培养条件下对工程菌的葡萄糖代谢途径及其代谢流分布的影响、ptsG与有机氮源代谢及类人胶原蛋白合成间的相互作用机理，建立了类人胶原蛋白基因工程菌的代谢模型及高效表达的工程工艺控制参数。.ptsG敲除对胞内碳代谢流的影响：ptsG敲除后引发了一系列激活反应形成cAMP-Crp，cAMP-Crp正向调控Cra，且cAMP-Crp和Cra相互调控，最终ptsG敲除菌的葡萄糖摄入和代谢更趋于平衡。在生长期，敲除有效地避免代谢溢流，减少乙酸积累量，增大TCA流通量；在诱导期，敲除ptsG基因能激活cya基因的表达，进而提高Mlc的浓度以促进类人胶原蛋白的表达，此外，cAMP-CRP增大σ32的表达量来增加分子伴侣蛋白的表达量，以保证过表达的类人胶原蛋白正确折叠。 .ptsG敲除对胞内氮代谢流的影响： PTSNtr系统中的PII-Ntr和Crp共同调节大肠杆菌的氮素同化，构建了碳氮代谢调节的桥梁。敲除ptsG后，为了与降低的碳通量相匹配，谷氨酰胺合成酶（高亲和力）的酶活及glnA转录水平降低，谷氨酸脱氢酶GdhA（低亲和力）的酶活及相应的基因转录水平显著增加，导致了GDH途径氮素同化通量的增大，即在氮源充足的情况下，ptsG基因敲除菌的氮代谢以谷氨酸开始。.本课题组开发了一套发酵控制系统以维持优化的发酵过程稳定。基于拟稳态操作过程的代谢流分析及代谢控制分析，发现分批阶段的碳氮比为2.36:1（mol:mol），诱导前为5.12:1（mol:mol），并控制诱导前后比生长速率分别为0.15-0.20 h-1和0.04-0.05 h-1，菌体量和类人胶原蛋白产量都提高了40%左右，且产量稳定，代谢副产物如乙酸的生成量显著降低。.该研究的成果一方面可直接用于类人胶原蛋白生产；另一方面，研究大肠杆菌的PTS代谢调控机理、氮代谢规律具有共性，可为其他重组蛋白的高效表达提供理论和方法指导。