基于甲基化结合蛋白的DNA甲基化分析及其在环境毒理学研究中的应用

DNA甲基化分析是表观遗学研究的重要手段，当前其分析水平难以满足发展迅速的环境表观遗传毒理研究的需要。MBD蛋白可特异性地与甲基化DNA结合，其亲和力最高可达nM水平，与高亲和的抗体相当，预期可开发为新型的DNA甲基化分析的亲和试剂。通过利用分子克隆和DNA重组技术，可实现重组MBD蛋白的高稳定的荧光标记和定向固定化，且可有效地保留被标记或被固定的蛋白质的天然特性。因此，我们提出利用重组技术和MBD蛋白结合甲基化DNA的特点，发展新颖的、多样化的DNA甲基化分析技术，以促进环境表观遗传学的研究。主要研究可分为四个部分：1）筛选和合成高亲和力、高特异性MBD蛋白；2）利用筛选的高亲和力、高选择性DNA甲基化结合蛋白，与高灵敏的CE-LIF技术结合，发展DNA整体甲基化水平测定的新技术、新方法；3）发展多基因的甲基化测定技术；4）以此为基础，筛选和评估重要环境污染物的表观遗传毒性。

DNA甲基化分析是理解环境污染物产生表观遗传影响的一种基本手段。我们通过利用分子克隆和DNA重组技术，设计合成出SNAP-MBD2b融合蛋白。其中MBD2b蛋白可与甲基化DNA特异性地结合，其亲和力最高可达nM水平，与高亲和的抗体相当；SNAP标签蛋白具有多重功能，即可方便易于吸附的MBD2b的纯化和应用，也可实现高效率的荧光标记和定向固定化。与传统的蛋白质固定化技术相比，定向固定化可有效地保留固定化蛋白质的天然特性。利用本实验室研制的毛细管电泳-激光诱导荧光分析装置，我们较为系统地研究了MBD2b蛋白与不同长度、不同甲基化密度的DNA探针的相互作用。研究发现，SNAP-MBD2b可特异性识别短寡核苷酸中的甲基化CpG，每个结合的SNAP-MBD2b占据约20个核苷；多个MBD2b同时结合显著降低了结合的选择性。离解动力学研究表明DNA链增长减小离解速率常数，从而显著增强了MBD2b的结合作用。这一相互作用研究为我们发展DNA甲基化分析方法、设计新的甲基化DNA识别蛋白提供科学依据。我们还利用超高效液相色谱-串列质谱法发展出高灵敏DNA甲基化分析方法；以发展的方法为基础，筛选和评估重要环境污染物的表观遗传毒性。已发表学术论文：JACS 3篇; Nucleic Acids Research 1篇; Scientific Reports 1 篇; Anal Chem 6篇; Anal Bioanal Chem 1篇; J Chromatogr. B 1篇。申请专利1项，培养博士生5名，客座硕士生2名。已按计划完成，达到预期目标。