缺氧诱导长链非编码RNA-LUCAT1在肝癌中的功能及其分子机制研究

HIF-1 alpha is induced by hypoxia to regulate transcription of its downstream targets, and participates into initiation and progression of hepatocellular carcinoma (HCC). It is important to understand HIF-1 alpha regulating signaling pathway in HCC, which helps to explore molecular mechanisms under HCC carcinogenesis and develop new therapeutic targets for HCC patients. In this study, we have identified hypoxia inducible long non-coding RNAs (LncRNAs) in HCC cells through RNA sequence and bioinformatic analysis. We found that LUCAT1 is induced by hypoxia in HCC cells and is up-regulated in HCC samples. Patients with high level LUCAT1 have a poor prognosis. These results indicate that LUCAT1 might have a crucial role in hypoxia regulating HCC carcinogenesis. In this study, we aim to explore the function of LUCAT1 in HCC cells and to identify molecular mechanism of LUCAT1 regulating proliferation and cell cycle progression in HCC. We specially focus on the regulation of LUCAT1 on TP53 signaling pathway, since we have found that knockdown of LUCAT1 activates TP53 pathway. The study on hypoxia regulating LUCAT1 will help us to understand HIF-1 alpha regulating signaling pathways in HCC and help to develop new therapeutic targets.

缺氧可诱导HIF-1 alpha的表达来调控一系列下游基因的转录参与肿瘤发生发展。对HIF-1 alpha调控信号通路的研究有助于深入理解肿瘤发生发展的分子机制，开发新的治疗靶点。在本项目中，我们通过RNA测序技术结合生物信息学分析的方法鉴定在肝癌中受缺氧调控的长链非编码RNA，并发现长链非编码RNA-LUCAT1在肝癌中可受到缺氧调控。LUCAT1在肝癌组织中表达升高，且其高表达与肝癌病人的预后差相关。本项目拟通过基因编辑技术敲除和激活肝癌中的LUCAT1，鉴定其在肝癌中的功能；通过ChIRP技术鉴定LUCAT1结合的蛋白和结合的DNA序列，研究其在肝癌中发挥作用的分子机制，重点研究LUCAT1对p53信号通路的调控。通过本项目的研究，有助于更好地理解长链非编码RNA在缺氧调控肝癌细胞功能中的作用，开发新的治疗靶点。

肿瘤快速生长导致缺氧情况的发生，而缺氧会导致其关键效应分子缺氧诱导蛋白1α稳定，从而诱导一系列与肿瘤生长、细胞周期、DNA损伤等相关基因的转录，包括长链非编码RNA。在本项目中，我们利用RNA深度测序方法鉴定在肿瘤中受到缺氧诱导上调的长链非编码RNA，并选择其中与缺氧诱导蛋白1α相关性最高的一个长链非编码RNA分子LUCAT1进行深入研究。缺氧可诱导LUCAT1的表达且LUCAT1在多个肿瘤样本中与缺氧诱导蛋白1α表达正相关。进一步研究发现缺氧诱导蛋白1α可直接结合在LUCAT1的启动子区并诱导其转录。LUCAT1可促进肿瘤细胞的体外生长和克隆形成能力，并促进肿瘤细胞的体内生长。RNA测序结果显示LUCAT1影响的基因主要富集在细胞周期、DNA损伤和G2/M检查点。体外研究表明LUCAT1 确实影响肿瘤细胞的DNA损伤和细胞周期。通过RNA pull down实验我们发现LUCAT1可结合PTBP1蛋白并影响其与下游与DNA损伤等相关的基因的剪切。PTBP1促进肿瘤细胞的生长、克隆形成并抑制细胞的DNA损伤水平。PTBP1过表达可回复LUCAT1敲降对肿瘤细胞体内外生长的影响，这些结果说明LUCAT1通过影响PTBP1下游的DNA损伤相关基因的剪切从而影响肿瘤细胞的体内外生长。缺氧可诱导肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。因此我们进一步探索LUCAT1在缺氧肿瘤对DNA损伤药物耐药的影响。结果显示LUCAT1可降低化疗药物诱导的肿瘤细胞的DNA损伤及凋亡。过表达LUCAT1的肿瘤细胞在DNA损伤药物处理时更具有生长优势。在裸鼠移植瘤实验中，LUCAT1反义寡核苷酸与DNA损伤药物联用组比单DNA损伤药物组治疗效果更好。这些结果说明LUCAT1可作为肿瘤治疗的靶点。同时，检测肿瘤病人样本中LUCAT1的表达，结果显示LUCAT1在肿瘤中表达显著高于相应的癌旁组织，且与肿瘤病人的预后相关。在新辅助治疗的病人中，LUCAT1的高表达与病人肿瘤消退评级差相关。对化疗药物没反应或部分反应的病人中LUCAT1的表达更高。这些结果说明缺氧可诱导LUCAT1转录水平上升促进其表达。LUCAT1进一步与PTBP1结合促进下游DNA损伤相关基因的剪切，从而使肿瘤细胞对化疗药物产生耐药。体内外实验表明LUCAT1可作为缺氧肿瘤耐药的新靶点，为肿瘤化疗抵抗提供新的治疗靶点。