长链非编码RNA作为肝癌分子标记的筛选及其功能研究

长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录长度超过200个核苷酸的非编码RNA。最新研究显示，lncRNA虽不能编码蛋白，但能在多种层面上调控基因的表达（表观遗传学调控、转录以及转录后调控等），并与microRNAs和靶基因构成了体内复杂的调节网络，参与多种生命活动。已证实，lncRNA与许多肿瘤的发生密切相关，但目前报道的与肝癌相关的lncRNA 仅有三个：H19、MALAT-1、HULC。我们前期预实验显示，多种lncRNA在肝癌及癌旁组织中存在着显著的表达差异，提示尚有许多未知的lncRNA参与了肝癌的发生 。本课题将采用转录组测序的方法获取肝癌转录谱，根据转录谱订制lncRNA芯片并结合qRT-PCR进行扩大病例数的筛选、验证，获取与肝癌发生特异相关的lncRNA，并通过后续的功能分析，以期从新的角度阐明肝癌发生发展的分子机制，同时为肝癌的诊断和靶向治疗提供新的线索。

肿瘤的发生是个复杂的生物学过程，原癌基因的活化、抑癌基因的失活和非编码RNA的结构变异和调节异常能够导致包括肝癌在内的各种肿瘤。本课题应用Human LncRNA Microarray v2.0表达谱芯片和Human 2.1M LncRNA Promoter Microarray启动子芯片对8例肝癌组织和癌旁组织样本进行检测，筛选肝癌组织中启动子高甲基化且表达水平显著下调的lncRNA 22个；应用实时定量PCR（qRT-PCR）、甲基化特异性PCR反应（Methylation specific PCR, MSP）对验证集(n=8和n=54)进行样本验证，发现LncRNA-SCARF1在肝癌组织中表达显著低于癌旁组织，且其启动子呈现高甲基化水平。用甲基化抑制剂5- 氮杂脱氧胞苷酸 (5’-Aza- dc )干预肝癌细胞株，qRT-PCR法和BSP法检测其LncRNA-SCARF1启动子CpG甲基化状态得到明显逆转(P<0.01)，而其表达量则显著升高(P<0.01)。同时肝癌细胞转染过表达LncRNA-SCARF1质粒后，发现可通过 PIK3CA/AKT/Bcl-2/Bax信号通路发挥其在肝癌细胞中的抑癌活性，实现对肝癌细胞增殖、侵袭、凋亡的调控。提示LncRNA-SCARF1启动子高甲基化水平引起其下调其表达，进而通过PIK3CA/AKT/Bcl-2/Bax信号通路影响肝癌发生发展。.鉴于大部分肝癌发生在由各种原因导致的肝硬化背景上，由慢性乙型或丙型肝炎－异型增生结节（Dysplastic Nodules, DN）－HCC逐渐演化、发展而来。课题组通过对比正常细胞基因组、DN基因组和HCC基因组遗传变异之间的差异，发现泛素连接酶E3C（UBE3C）存在 HCC相关遗传突变。研究结果发表在“Hepatology” （2014年）。在肝癌组织中还发现若干与肝癌转移复发相关的新型标志物，包括小热休克蛋白Cryab、趋化因子CXCL5和乙醛脱氢酶3A1（ALDH3A1）等。研究结果以通讯作者发表在“Hepatology” (2013年) 、“Int J Cancer”（2013年）和“Cancer letters”（2015年）。.课题负责人为2012年度国家杰出青年科学基金获得者。以第一或通讯作者发表与本课题相关的论文8篇，均为SCI收录。