长链非编码RNA HULC在肝癌中的生物学功能及机制研究

Non-coding RNAs (ncRNAs), which transcript from DNA but do not encode protein, contein high density of stop codons or lack extensive "Open Reading Frame".They have been shown to be involved in different levels of cell regulations including chromalsome modification, transcription regulation, RNA splicing and RNA stability, via RNA-RNA basepair, RNA-protein interaction, RNA-DNA interaction. Recently, dysregulated expressions of ncRNAs have been reported in many types of cancers, indicating that they maybe play critical roles in tumorigenesis. HULC (Highly Up-reglated in Liver Cancer), is a ncRNA characterized in hepatocelluar carcinoma (HCC). The HULC gene locates at 6p24.3 and the transcripts of this gene is spliced and polyadenylated like mRNA to form a 500bp RNA. Feature of the HULC RNA sequence is the high density of stop codons in the small potential reading frames and can not encode a protein product. HULC RNA can be detected in HCC tissues as well as in the blood of HCC patiens at a high level. It has also been reported that HULC expression is not confined to HCC, but also to those colorectal carcinomas that metastasize to the liver. HULC RNA can therefore be used as specific molecular markers for HCC. However, little is known about the function of HULC RNA and its molecular mechanism..In the previous study, we have found that HULC RNA could promote cell proliferlation, migration and invasion in vitro and also inhibite autophage and cisplatin-induced apoptosis. Moreover, we have shown for the first time that HULC RNA can specifically bind to YB-1 protein. YB1 protein appears to carry out multiple functions, including the roles in transcriptional and translational regulaiotn, RNA splicing and masking, DNA repair, and cell proliferlation. Thus, our project will mainly study the cause and mechanism of how HULC RNA promoting cell malignancy, and clarify the binding mechanism and function of HULC RNA and YB-1 protein. We hope this study will help us to understand the roles of long non-coding RNAs in tumor pathogenesis and provide theoretical support for tumor diagnosis marker and therapeutic target.

长链非编码RNA是一类由基因组转录但并不翻译的长度大于200bp的RNA分子，它们通过不同机制，如RNA-RNA碱基配对，RNA蛋白相互作用，RNA-DNA相互作用等，在细胞调控的各个层面中发挥功能，如参与染色质修饰、转录调节、剪切加工、RNA稳定性调节等。HULC RNA是一种在肝癌中特异高表达的长链非编码RNA分子，长度大约在500bp，具有polyA尾的结构，但其在肝癌中高表达的生物学功能和分子机制鲜有报道。我们的前期研究发现HULC RNA能够促进细胞的增殖、迁移及侵袭能力，并能抑制自噬和顺铂诱导的细胞凋亡，且HULC RNA与YB1蛋白相互作用。因此，本项目将重点研究HULC RNA促进细胞恶性表型的原因和机制，阐明HULC RNA与YB1蛋白的结合机制及功能，促进我们对长片段非编码RNA在肿瘤病因学中功能的认知，并为未来HULC RNA作为肿瘤诊断标志物及治疗靶点提供理论支持。

肝癌是全球范围内致死率最高的肿瘤之一，而我国又是肝癌的高发国家，每年有超过30万的病人死于肝癌。2007年，研究者们通过运用肝癌特异的cDNA芯片平台发现了一种表达明显升高的长度为500nt的非编码RNA HULC，但关于HULC RNA详尽的生物学功能及分子机制目前还未知。 .为了深入研究HULC RNA的生物学功能，我们的前期研究发现HULC能够促进细胞的体外增殖、迁移及侵袭能力，并能抑制顺铂诱导的凋亡。此外，我们还发现敲降HULC能够引起细胞自噬的升高，为了阐明HULC发挥这些生物学功能的分子机制，我们设计了RNA Pull-down实验，利用RNA分子钓取与之结合的特异性蛋白，并通过质谱技术鉴定该蛋白为Y-box binding protein 1(YB1)。.按照任务书计划安排，在现有的研究基础上，对非编码RNA HULC的功能及机制做了进一步深入的研究，获得了较好的研究成果。我们检测了HULC在肝癌中的高表达与临床分期等数据的相关性以及预后情况，发现HULC的高表达肿瘤细胞分化程度及肿瘤大小呈正相关；我们通过高通量芯片的方法，分析了HULC对其他基因表达情况的影响，发现66个表达差异的基因，其中上调34个基因，下调32个基因。并对这些基因进行了信号通路分析，发现7条主要改变的信号通路，特别是MAPK信号通路；我们通过xCELLigence系统检测了HULC对细胞的增殖能力的影响，发现HULC能促进细胞的增殖能力，并且通过流式细胞仪发现HULC促进了细胞G1/S期的转化；我们还通过western-blot实验，竞争性结合实验、RIP实验、RISH及免疫荧光实验验证了HULC与YB-1蛋白的结合，并通过片段化实验，确定了HULC与YB-1结合的区域；对于HULC与YB-1结合的分子机制，我们也做了进一步的研究，发现HULC可以影响YB-1的磷酸化，并且这种调控是通过ERK激酶实现的。YB-1的磷酸化可以促进其与靶mRNA的解离，从而引起这些mRNA的翻译，包括cyclinD1、cyclinE1、MMP11等，而这些癌基因的翻译会促进细胞的恶性表型。.这些研究结果阐明了HULC在肝癌中的生物学功能和分子机制，为将来HULC作为肝癌治疗的靶点提供了研究基础，并且揭示了lncRNA通过影响结合蛋白磷酸化修饰来发挥功能的新的机制。