植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶结构与功能关系的研究

Linoleic acid isomerase (LAI) catalyzes linoleic acid into conjugated linoleic acid (CLA) has many beneficial physiological functions. Clearing the relationship between structure and catalytic function of LAI and how to extend and enhance LAI activity have important significance for the mass production of CLA and is also current hotspot.This project aims to combine molecular biochemistry and cutting-edge nanotechnology ,depth study of relationship between structure and function of LAI. Using gene recombination,gene mutation and protein purification technology, prepare recombinant LAI and mutant LAI of L. plantarum P-8, analyze the change of enzymatic activity.Use quantum dots to label LAI, microencapsulate LAI via Layer-by-Llayer Assembly, make detection of binding of LAI to enzyme-interacted molecular using fluorescence resonance energy transfer method , analyze function of several structural domains and essential groups .

亚油酸异构酶(LAI)可催化亚油酸转化为对健康非常有益的共轭亚油酸（CLA）。搞清LAI的结构与其催化功能的关系以及如何延长和提高LAI的酶活力对CLA的量产具有重要意义，也是当前研究的热点。本项目拟结合分子生物化学与与前沿纳米技术，深入研究植物乳杆菌P-8 LAI的结构与功能关系，采用基因重组技术、蛋白突变等技术和蛋白纯化技术制备重组LAI及其缺失和点突变体，分析其酶活力变化；采用逐层组装法将用量子点标记的LAI及其突变体微囊化，利用荧光能量共振转移方法检测与互作分子的结合情况，分析LAI几个结构域的功能和酶的必需基团及其功能。

亚油酸异构酶系可催化亚油酸转化为对健康非常有益的共轭亚油酸（CLA）。其组成、结构与催化功能的关系以及CLA转化机制对CLA的量产具有重要意义，也是当前研究的热点。项目通过基因工程手段、酶和菌体催化和代谢产物分析的手段，对植物乳杆菌P-8 亚油酸异构酶系的组成及转化CLA能力进行了研究，发现CLA的转化由脂肪酸水合酶（CLA-HY）、羟基脂肪酸脱氢酶(CLA-DH）和乙酰乙酸脱羧酶（CLA-DC）酶催化，还与烯酮还原酶（ER）和烯醇化酶（XC）相关；发酵液和菌体中都有CLA转化，但是异构体的种类及转化率有所不同。利用聚电解质层层自组装技术将重组LAI微囊化后活力下降，但稳定性提高。然后借助突变技术、酶活力分析和酶与底物分子对接方案预测结合模式，对两个关键酶CLA-HY和CLA-DH的结构和功能进行了研究，确定了CLA-HY 的16个必需基团中W415是催化基团，I205、T185、R75、Y82、M76、F208、F186、V397、M204、M149、H399、P151、M201、I148和L144为结合基团，T185D、Y82F、F186H、R75A和W415H突变体活力提升；CLA-DH 的28个必需基团中V229、V191、I144、A142、L195、T193、Y156、D194、H201、I38、N90、S143和I93是结合基团，T198是催化基团，G189和I93与辅酶的结合有关，突变体V191E、D194H、Y156G和I93S活力提升。最后，借助qPCR和代谢产物分析对不同底物浓度诱导和有机溶剂胁迫下CLA转化及其机制进行了初探，发现不超过0.05mg/mL底物浓度诱导和0.5%的有机溶剂胁迫可以提高CLA转化效率和CLA转化相关的五个酶基因的转录水平，且三种异构体的转化率有所不同。该研究结果使我们更好地掌握亚油酸异构酶系的催化特性和机理，为进一步通过酶分子的改造和控制催化条件酶法工业化生产CLA或其中间代谢产物提供理论依据。