β-乳球蛋白的结构特性和与非健康细胞的作用规律以及构建亚油酸异构体系统的稳定性研究

The major whey protein, β-lactoglobulin(β-LG), is also a core member of the Lipocalin family, which has a special calyx structure, being suggested to bind with small hydrophobic molecules as fatty acids and cholesterol. The currently focuses of β-LG in our country is mainly on its food allergic property and gene expression. Although several attempts have been made to identify some anti-cancer substances might bind with β-LG to complex in foreign countries, only stability and particle properties of the complex has been intensive investigated..According to the calyx structure,β-LG from Buffalo milk and Hostein milk will be seperated and purificated; the carcinoma cell receptor, cellular intenaliztion ability and the manners of transportation for β-LG will also be discussed, which could provide basis for β-LG loaded conjugated linoleic acid isomers as a kind of the oral colon targeting drug dilivery system. The stability and feasibility of this oral colon targeting drug dilivery system will be studied, which could support a technical method for food-borne targeted substances preparation.

牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-LG)是乳清中一种主要蛋白,同时它还是Lipocalin家族成员，具有特殊的calyx空间结构,该结构具有结合脂类以及某些甾类疏水小分子的特性。目前国内对β-LG的研究主要集中在致敏性分析方面，而将其作为疏水小分子的药物载体还没有相关的报道。国外虽已发现一些抗肿瘤疏水物质可以与β-LG结合，但主要停留在粒径、稳定性等物理化学性质方面。.本研究在前期工作的基础上，根据β-LG的calyx结构特性，拟通过分离提取水牛乳和赫斯坦牛乳中的β-LG，研究分析并确定其亚型在肠道肿瘤细胞上对应的细胞受体，探索该细胞受体与β-LG的结合能力及对疏水分子的转运方式，为β-LG负载的共轭亚油酸异构体口服结肠靶向给药系统模型提供依据；研究以牛β-LG为载体的口服结肠靶向给药系统模型的稳定性和可行性，为食源性靶向药物的制备提供一种技术支持。

牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-LG)是Lipocalin家族蛋白的一员，其结构特性为β-LG作为口服结肠定位给药系统(Oral colon-specific drug delivery system, OCDDS)的疏水性抗肿瘤药物载体提供了很好的理论基础。有关β-LG与肠道非健康细胞的相互作用研究还未见报道，β-LG是否能作为靶向肠道给药系统的载体负载抗肿瘤物质有待于深入研究。.课题主要研究了 (1)从牛乳中提取和纯化β-LG，并通过对其晶体结构分析及蛋白质组学分析，明确β-LG A B型在三维空间构象上的差异，并比较它们与疏水分子的结合能力；(2)研究肠道肿瘤细胞对β-LG的特异受体，探索该细胞受体与β-LG的结合能力及对疏水分子的转运机制；(3)构建β-LG-疏水分子复合物，检测胃肠道pH、消化道酶、温度、不同时间作用下β-LG-疏水分子复合物的稳定性，研究各种稳定剂对β-LG-疏水分子复合物稳定性的促进效果。.研究结果:(1)建立了聚乙烯比咯烷酮(polyvinylpyrrolidone, PVP))-柠檬酸钠双水相体系，与膜分离相结合，将β-LG和α-乳白蛋白分别从乳清中很好的分离出来。分离条件是：17.80% (w/w) PVP 3500 、21.71%(w/w) 柠檬酸钠、 pH 7.0；膜分子量30kDa。该提取方法环保、高效，对α-乳白蛋白提取率为90.14%，β-LG提取率为98.30%。(2)肠道肿瘤细胞中存在与β-LG相互作用的蛋白是组蛋白H4、核糖体蛋白S18、S25，共3种蛋白，未发现细胞受体；β-LG是以胞吞的形式进入肠道肿瘤Caco-2、Lovo细胞，与核蛋白相结合；β-LG负载的疏水分子复合物可直接进入肠道肿瘤细胞。(3)β-LG的构型对于疏水分子的结合能力无显著影响，荷斯坦牛乳与水牛乳源β-LG与c9,t11-CLA的结合系数分别为3.7×106 M-1和4.0×106 M-1；β-LG-疏水分子复合物在胃肠道pH下稳定，经过2h的胃蛋白酶作用，β-LG轻微降解；Tween-40能较好的增加复合物的稳定性。.本课题的研究为分离乳清中β-LG和乳白蛋白提出了一种双水相体系方法；研究了β-LG与肠道肿瘤细胞的相互作用蛋白，为β-LG负载抗肿瘤疏水物质作为靶向肠道给药系统的开发提供理论支持。