BMP4信号通路在卵巢生殖干细胞分化过程中的作用及其机制研究

Ovarian aging is an important factor that seriously impairs women's health. The differentiation of oogonial stem cells(OSCs) into oocytes is expected to be a new strategy to delay ovarian aging. The molecular mechanism of how OSCs differentiate into oocyte remains unclear. We have established the mouse and human OSCs cell lines, and found that the BMP4 factor can promote differentiation of OSCs. And we have done transcriptome high-throughput sequencing on the OSCs before and after the treatment of BMP4, finding that the genes Sohlh1, Sohlh2, Lhx8, which are related to the formation of eggs have a significant difference. We hypothesized that BMP4 might contribute to the differentiation of OSCs by regulating the genes above. In this study, using the OSCs modern in which GFP gene was controlled under the promoter of DDX4 gene, and combined with biological information analysis prediction, chromatin immunoprecipitation assay (CHIP) and CRISPR / cas9 gene editing technology. We plan to explore the downstream key genes and molecular regulation of the BMP4 signaling pathway, so as to construct the network diagram about that how the BMP4 signaling pathway regulates the differentiation of OSCs, thus providing theoretical basis for the clinical application of OSCs for delaying ovarian aging.

卵巢衰老是严重危害女性健康的重要因素。卵巢生殖干细胞（oogonial stem cells,OSCs）定向分化为卵母细胞可望成为延缓卵巢衰老的新策略。OSCs如何分化为卵母细胞的分子机制尚不清楚。我们前期已建立小鼠及人的OSCs细胞系，并发现BMP4因子可以促进OSCs分化；对添加BMP4因子前后的OSCs进行转录组测序，发现与卵子形成相关的基因（Sohlh1，Sohlh2，Lhx8）具有显著表达差异。我们推测BMP4可能通过调控上述基因促进鼠与人OSCs的分化。本研究拟采用DDX4启动子调控的绿色荧光蛋白标记的卵巢生殖干细胞(DDX4/EGFP-OSCs)，联合生物信息学分析预测、染色质免疫沉淀技术（ChIP）、CRISPR/Cas9基因编辑技术等探讨BMP4下游关键基因及其调控分子，从而构建BMP4信号通路调控卵巢生殖干细胞分化的网络图，为临床运用OSCs延缓卵巢衰老提供理论依据。

卵巢衰老是一个多因素影响的复杂过程，其根本原因在于卵巢内有限卵泡数目的耗竭，而卵巢生殖干细胞（oogonial stem cells, OSCs）定向分化为卵母细胞有望为延缓卵巢衰老提供新策略，但OSCs如何分化为卵母细胞的分子机制尚不清楚。本项目组在前期已经建立的小鼠OSCs细胞系基础上，进一步优化分离培养方法，建立了稳定的小鼠OSCs分离培养体系；并对小鼠OSCs的分化条件进行探索，构建了卵巢生殖干细胞分化体系并揭示BMP4因子参与调控小鼠卵巢生殖干细胞的分化；通过CRISPR-Cas9基因敲除技术证实BMP4因子通过调控Hippo信号通路中的YAP参与卵巢生殖干细胞的分化；同时，我们构建了人卵巢生殖干细胞（human oogonial stem cells, hOSCs）的分离培养体系，通过人卵巢皮质移植模型和卵巢微注射技术证实hOSCs具有体内外分化的潜能；在建立的人卵巢生殖干细胞体外分化体系中，我们进一步揭示BMP4因子参与促进hOSCs的分化。对添加BMP4因子诱导前后的hOSCs进行转录组测序，结果提示卵母细胞特异性基因和减数分裂相关基因表达明显上调；KEGG、GSEA深入分析结合实验验证证实氧化磷酸化参与BMP4调控的人卵巢生殖干细胞分化。至此，本项目通过体内外实验明确了BMP4在生殖干细胞分化中的重要作用及机制，为卵巢衰老的研究提供技术支持并奠定理论基础，为进一步寻求延缓卵巢衰老的方法提供了重要参考依据。依托此项目共发表SCI论文7篇、中文3篇，培养了博士生3名和硕士生2名。