Hedgehog信号调控小鼠雌性生殖干细胞增殖分化对重塑卵巢功能的机制研究

The proliferation and differentiation of germ stem cells is a key methods to solve functional decline and aging of the reproductive organs. In recent years, it is become a hotspot for the isolation、identification and regulation of female germline stem cell(FGSC) after the birth in mammals, however, the specific regulatory mechanism of FGSC is unknown.It is proved that Hedgehog(Hh) pathway regulated the proliferation and differentiation of fruit fly FGSC as well as other stem cells. After confirmed the exist of FGSC, we found there is a Hh pathway in mice FGSC which maybe plays a key role for FGSC in mammals. We will propose to analyze the role of Hh pathway in the proliferation and differentiation of FGSC;at first, we will construct lentivirus overexpress/shRNA vector of the key transcription factor Gli1 of Hh pathway and transfer the lentivirus vectors to FGSC, and construct FGSC stable cell line by G418, then observe the follicle development and pregnant after transplant FGSC stable line to mouse model of ovarian infertility;next we will explore the recovery of ovarian function by microinjecting the lentivirus vectors to ovarian infertility and provide experimental basis for remodeling ovarian function.

研究生殖干细胞的增殖和分化是解决生殖器官功能下降和衰老的关键手段。近年来，出生后雌性哺乳动物生殖干细胞（FGSC）的分离鉴定和调控成为研究热点，然而其具体调控机制尚未明确。现有报道表明，对多种干细胞增殖、分化起重要调控作用的Hedgehog通路，也调控着果蝇生殖干细胞的增殖和分化。我们在证实FGSC存在的基础上，发现此通路同时存在于小鼠FGSC中，故推测Hedgehog通路可能是调控哺乳动物FGSC增殖和分化的关键通路。本项目拟通过分析Hedgehog通路在FGSC增殖和分化中作用；通过Hedgehog通路关键转录因子Gli1高表达载体/Gli1-shRNA载体介导此通路活性在FGSC高/低表达后，将此FGSC移植到不孕模型小鼠卵巢中，观察卵泡形成发育及产仔影响；通过卵巢内微注射Gli1高表达载体/Gli1-shRNA进一步观察对不孕模型小鼠卵巢功能恢复的影响,为卵巢功能重塑提供实验依据。

FGSCs是解决雌性动物生殖功能下降和衰老的关键手段，但此类细胞在卵巢内数量少、增殖慢，移植至受体体内存活率低，虽然目前实验室可以原代分离和鉴定FGSCs，但调控其增殖的机制尚未明确。研究发现，对多种干细胞增殖起重要调控作用的Hh通路，也调控着果蝇生殖干细胞的增殖。我们成功原代分离FGSCs后，检测到Hh通路也存在于小鼠FGSCs中，故推测Hedgehog通路可能调控着哺乳动物FGSCs增殖能力。在此，本项目主要研究：Hh信号通路关键分子在卵巢皮质中的表达及动态变化，其表达和变化与生殖干细胞及卵巢年龄的关系；活体和离体的不孕/孕龄卵巢，激活/抑制Hh信号通路，观察对卵泡发育、数量和FGSC增殖的影响；激活Hh通路后的FGSC细胞系，移植入不孕小鼠卵巢内，检测卵巢内卵泡的形成及交配后的产仔情况。我们的结果阐明：经典的Hh信号通路在不同生殖年龄阶段卵巢皮质表达活性呈现动态变化，随着卵巢的衰老，Hh通路活性逐渐下降；随着卵巢的衰老，卵巢皮质层内的FGSC数量减少；Hh通路在调控卵巢衰老和卵泡数量中发挥重要作用，抑制通路的活性后卵泡数量下降，卵泡发育受阻；对于卵巢早衰，当激活Hh通路时，可以部分恢复卵巢发育，卵巢数量增加；Hh信号通路对FGSC增殖具有重要影响，抑制通路活性后FGSC增殖能力下降，对POF小鼠，当激活通路活性后，可以恢复部分卵巢的生殖能力。本课题的意义着重阐明：改变Hh信号通路在不孕模型小鼠卵巢中的活性后，对卵巢功能的重塑和拯救作用，其机制可能为通过促进FGSCs的增殖，补充原始卵泡池，启动卵泡发育。本项目为临床治疗不孕及卵巢早衰提供新的思路和方法，以及为不孕症的治疗及延缓衰老提供技术方法和新的药物靶点。