ALG-2/ALix与宫颈癌发生发展的关系及其作用机理研究

宫颈癌排我国妇女恶性肿瘤第二位，每年新增13万多病例。新近研究结果提示，肿瘤的发生发展与肿瘤细胞能逃避各种刺激诱导的程序性细胞死亡密切相关，而凋亡相关基因-2(ALG-2)及其受体Alix既可诱导细胞死亡，又可促进细胞增生，并主要在TNF-R1及内质网应激等多种途径诱导的细胞死亡信号通路中起重要作用。研究结果显示，在128种肿瘤中，30-40%的肿瘤组织ALG-2蛋白表达异常。我们对宫颈癌的前期研究发现，宫颈癌组织中ALG-2和Alix mRNA表达均降低，提示ALG-2/Alix可能在宫颈癌发生发展中起着关键作用。本研究拟从DNA遗传变异、mRNA和蛋白表达、蛋白亚细胞定位角度，深入研究ALG-2/Alix与宫颈癌发生发展的关系及其作用机理，并采用质粒转染使目的基因高表达以及基因沉默技术，研究其对宫颈癌细胞死亡/存活的影响，探索干预ALG-2/Alix表达调控抑制宫颈癌发生发展的新途径。

宫颈癌在我国妇女恶性肿瘤中排第二位，每年新增约13万病例。凋亡相关基因-2（ALG-2）既可诱导细胞死亡，又可促进细胞增生，在多种途径诱导的细胞死亡信号通路中起着重要作用。本项目研究对ALG-2基因两个Tag SNPs位点（rs3756712及rs4957014），在328例宫颈癌患者及541例健康对照者中进行了群体遗传学研究，发现上述两个SNP位点与宫颈癌密切相关。采用变性高效液相色谱法（DHPLC）对ALG-2/Alix基因进行了全面的突变筛查，在宫颈癌患者组中新发现ALG-2基因突变位点：ALG-2基因 C191T突变，导致蛋白苏氨酸64异亮氨酸突变。qPCR以及Western Blot结果表明，ALG-2 mRNA和蛋白在宫颈癌组织中均降低。构建了基于液相芯片分析系统LiquiChip 200平台，检测血清ALG-2蛋白表达的实验技术方法与相应的检测试剂盒，发现宫颈癌组中血清ALG-2蛋白显著降低。克隆ALG-2基因后，构建了ALG-2/pEGFP-C1野生型及ALG-2 C191T/pEGFP-C1突变型重组表达质粒，构建了特异性针对ALG-2基因的siRNA，分别转染HeLa细胞。课题组选择了22个重要的基因，采用ROCHE公司的Universal ProbeLibrary探针法，检测上述基因mRNA表达，发现siRNA组Fas基因表达显著下调，而野生型ALG-2质粒组中Fas基因表达显著上调；ALG-2 C191T基因突变导致Fas及RAF1基因表达显著上调，而DAPK1及PTPN23基因表达则显著下调。本研究达到了预期目标：首次从群体遗传学研究、DNA遗传变异筛查及突变功能研究、组织中mRNA与蛋白表达以及血清蛋白浓度检测等多个角度证实ALG-2与宫颈癌的发生发展密切相关；siRNA抑制ALG-2表达或转染ALG-2质粒增强其表达后，均显著影响Fas基因表达；在宫颈癌患者中新发现ALG-2基因突变位点ALG-2 C191T，该突变影响Fas、RAF1、DAPK1及PTPN23等基因表达；首次构建了采用液相芯片技术检测血清ALG-2蛋白的方法与试剂盒，发现宫颈癌患者中血清ALG-2显著降低。本项目研究的顺利完成，为宫颈癌发病机制研究、ALG-2及相关基因的深入研究以及ALG-2在宫颈癌中的转化应用研究等奠定了基础。