LPA-LPAR1信号通路调控放射性肺损伤的机制研究

Radiation-induced lung injury (RILI) is a common and serious complication in the radiation therapy of lung cancer. The prevention and treatment of RILI have long been a clinical challenge. The epithelial cells and fibroblasts are the main target cells in RILI. Lysophosphatidic acid (LPA) is a small bioactive phospholipid known to regulate several cellular processes via binding to its receptors (LPAR). In our previous studies, we confirmed that LPA concentration was increased significantly in the plasma of lung cancer patients at the onset of radiation pneumonitis; the level of LPA in the lung was increased in RILI mice model; LPAR1 inhibitor effectively alleviated the lung injury and prolonged animal survival. Current research and our previous works indicate that LPA-LPAR1 signaling pathway may play the paradoxical role between epithelial cells and fibroblasts: LPA-LPAR1 may promote the apoptosis and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of the epithelial cells; LPA-LPAR1 may also promote the apoptotic resistance and migration of the fibroblasts. In the further study, we will complete the preliminary studies and determine the exact molecular mechanism of LPA-LPAR1 signaling in the regulation of RILI. Our study may provide new insight and avenue for the prevention and treatment of RILI in clinic.

放射性肺损伤（RILI）是肺癌放疗常见及严重并发症，目前尚缺乏有效治疗手段。上皮细胞及成纤维细胞是RILI的主要效应细胞。LPA是一种磷脂类小分子物质，通过其受体发挥广泛的作用。我们前期工作证实：发生放射性肺炎的患者，血浆中LPA明显升高；小鼠全肺照射后，肺组织LPA升高；动物实验证实抑制LPA受体1 (LPAR1)可以显著减轻RILI，提高小鼠生存。基于文献报道及我们的前期工作，提示：LPA-LPAR1信号通路具有促使上皮细胞及成纤维细胞稳态失衡的作用，一方面可以促进上皮细胞凋亡和上皮间质转化，另一方面促进成纤维细胞凋亡抵抗和迁移。本课题将通过分子生物学手段及转基因小鼠杂交模型，深入研究LPA-LPAR1信号通路调控RILI的分子机制。本课题组的研究有利于从新的视角揭示RILI的分子病理过程，为RILI的防治提供新的思路和方法。

目的：电离辐射（IR）损伤可直接或间接引起细胞DNA损伤，造成基因组不稳定。DNA损伤可致细胞发生周期永久性阻滞（即失去增值能力），细胞体积增大数倍，同时代谢活跃，胞质β-半乳糖苷酶（PH=6）阳性，分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子以及上调抗凋亡Bcl-2家族等，综合起来称为细胞衰老（cellular senescence）。放射治疗是肺癌治疗最有效的方法之一。然而，辐射对正常肺组织的急性和晚期毒性限制了可应用于肿瘤的辐射剂量。现有研究证实RILI的发病机制可能与细胞衰老有关。我们已在小鼠模型中证实，IR导致肺部产生的大量溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)与RILI密切相关，本研究旨在探索放射性肺损伤所致细胞衰老及与LPA-LPA1信号通路的关系。.方法：将SPF C57BL/6J小鼠全胸部接受16 Gy/f的X射线照射。通过蛋白质印迹、RT-PCR、免疫组织化学方法、流式细胞术等在不同时间点分析照射的小鼠肺的细胞衰老水平。用AM966（15 mg/kg，q.d.）对接受照射小鼠进行腹腔，注射从放射第1天开始。 为了探索IR诱导的细胞衰老的潜在机制，将HBE和HUVEC细胞也进行16 Gy/f辐射，并加入LPA（10 μM）和/或AM966（20 μM），以及MK 2206（5 μM）处理，在照射后48小时，用体内研究类似的方法进行体外细胞研究。.结果：照射后第14天，小鼠肺组织开始出现明显的SA-β-gal染色，在第60天达到高峰并伴有广泛的肺纤维化。 细胞凋亡活性在第7天达到峰值，但在其后时间点显著降低。从照射后第7天开始，IL-1α，IL-1β，IL-6，TGF-β，TNF-α等SASP因子水平升高。AM966可显着改善照射后第7天和第28天时的细胞衰老水平和放射损伤。细胞实验中，90％以上的HBE和HUVEC细胞在照射48小时后出现G2 / M期停滞，并表现出高水平SA-β-gal活性。AM966和pan-Akt抑制剂MK 2206明显改善该情况。此外，AM66还降低了辐照后的HBE和HUVEC细胞中γH2AX的焦点数目和活性氧的水平。.结论：LPA可促进肺组织中辐射所致的细胞衰老，AM966治疗可以显著改善该病理进程的早期阶段，抑制DSB和SASP因子的形成可能是其作用的潜在机制。