从影响RIP1泛素化探讨p62在人卵巢癌细胞顺铂耐药机制中作用的研究

The imbalance between cell survival and cell death is a relatively important fundamental factor resulting in tumor drug resistance,thus looking for a master switch that regulates cell survival and death is of great significance to overcome this puzzle.Our study found that high expression of the multifunctional adapter protein p62 positively correlates with resistance of tumor cells to cisplatin;to further explore the role of p62 in cisplatin resistance,based on literature readings and the preliminary work,a key focus of this study is to figure out how p62 regulates the ubiquitination of critical molecules involving in the death-survival signal.The ubiquitination level of receptor interacting protein 1 (RIP1),which could directly bind to p62,determines its role as a pro-death or pro-survival factor.We assume that p62 interacting with RIP1 may participate in tumor resistance to cisplatin by affecting NFκB activity.In this study,the parental SKOV3 and cisplatin-resistant SKOV3/DDP human ovarian carcinoma cell lines are adopted,through inhibiting the expression of p62 by small interfering (si)RNA or by constructing expression vectors containing a zinc finger (ZZ) domain or the UBA domain mutations within p62,we aim to observe how p62 regulates the ubiquitination of RIP1 and the activity of NFκB,thereby clarifying the role of p62 in cisplatin resistance.

细胞存活/死亡机制的失衡是导致肿瘤细胞耐药的根本，寻找调控细胞存活/死亡的关键分子开关在克服肿瘤耐药机制研究中具有重要意义。我们的研究发现多功能衔接蛋白p62高表达与肿瘤顺铂耐药性正相关，为进一步深入探讨p62在顺铂耐药中的作用，在综述文献和前期工作的基础上，本研究的着眼点放在p62调控重要存活/死亡信号关键分子的泛素化上。受体相互作用蛋白1（RIP1）可与p62直接结合，泛素化形式决定其发挥存活还是死亡功能。我们假设p62和RIP1的相互作用通过影响NFκB活性参与肿瘤顺铂耐药机制。本研究以顺铂作用下人卵巢癌SKOV3细胞（亲代）和SKOV3/DDP细胞（顺铂耐药）为实验模型，分别构建p62 si-RNA、p62 ZZ结构域突变、UBA结构域突变表达载体，观察其对RIP1泛素化形式、IKKs-NFκB活性信号通路活性影响，从调控RIP1泛素化角度探讨p62在顺铂耐药机制中的作用。

肿瘤细胞依靠多因素、多途径维持自身稳态拮抗化疗药物的杀伤作用，最终导致肿瘤细胞耐药的形成。肿瘤细胞稳态的维持受许多交互的分子信号传导途径影响，而可与许多其他蛋白“交流”的“枢纽”蛋白，在其中可能起着更为关键的作用。多功能蛋白SQSTM1/p62参与调控复杂的细胞内网络通路,维系肿瘤细胞的稳态，从而成为调控细胞存活/死亡的关键分子开关。我们的研究工作以p62为研究靶标，揭示其在肿瘤细胞拮抗化疗药物维护细胞稳态中的作用，以期有助于解决肿瘤化疗耐药难题。我们的研究结果显示人卵巢癌细胞中RIP1 K63泛素化水平增高、NFκB信号通路活性增高是其对抗顺铂损伤作用的重要机制之一，而抑制p62表达通过影响RIP1泛素化形式调控NFκB信号通路逆转卵巢癌顺铂耐药，即RIP1-NFκB信号通路发挥抗顺铂杀伤作用是p62表达水平依赖的。为进一步探讨p62对RIP1泛素化形式的调控机制及其在卵巢癌顺铂耐药中的作用，我们以过表达p62全长的人卵巢癌细胞为对照，观察过表达不同功能结构域截短的p62片段对顺铂作用下RIP1-NFκB信号通路活性的影响，结果显示p62调控RIP1-NFκB信号传导通路在卵巢癌顺铂耐药机制中发挥作用主要依赖于ZZ结构域，该过程与细胞自噬无关。p62 UBA结构域缺失反而增加p62与RIP1的结合，但对RIP1泛素化形式和NFκB信号通路活化没有明显影响。UBA结构域缺失可引起Caspase8活化减少，tBid生成减少，经线粒体途径凋亡减少，而抑制自噬起始可进一步降低SKOV3细胞对顺铂的敏感性。我们的研究工作也在临床肿瘤患者标本上进行了p62和NF-κB表达的检测，明确了p62参与人恶性黑色素瘤细胞NF-κB活性调控，并以NFκB抑制剂SAS为工具，进一步探讨了p62参与调控肿瘤细胞NF-κB信号通路和凋亡的机制。综上，我们的研究工作证明，p62可通过ZZ结构域参与调控RIP1-NFκB信号通路，其UBA结构域参与依赖于自噬的caspase8激活介导的凋亡通路，两者均在肿瘤细胞顺铂耐药机制中发挥作用。多功能蛋白p62作为肿瘤细胞内多信号通路交汇点，发挥了促存活和促死亡的双重作用，进一步明确其不同功能结构域在细胞内重要信号通路调控中的作用，可加深对肿瘤耐药机制的认识，使其成为有希望的逆转肿瘤耐药的治疗标靶。