稻瘟菌转运子MoABC-R1基因介导的抗药性分子机理解析

Fungicide resistance of Magnaporthe oryzae has reduced the effectiveness of chemical control for the disease. Dissection of the molecular mechanism underlying M. oryzae fungicide resistance will provide us new knowledge to better use fungicide or design new fungicides. Previous studies indicated that most of the M. oryzae resistance to the fungicides is due to the mutations in the fungicide target genes. In this study, we found a new type of blast fungicide resistance mediated by the fungal transporter gene MoABC-R1 using population genetics, genomics and molecular biology methods. This gene encodes an ABC-type transporter. Knockout of MoABC-R1 causes a complete loss of resistance of M. oryzae to fungicide of Pyraclostrobin, and also partial loss of resistance to another fungicide, Azoxystrobin, suggesting that the the MoABC-R1 gene is one of the key factor of fungicide resistance and may play a multidrug resistance (MDR) role in M. oryzae. Based on above results, we propose to conduct a functional complementation of the MoABC-R1 gene by transferring wild type MoABC-R1 gene to the knockout mutant. In addition, we propose to analyze its subcellular localization, substrate-binding site, inside and outside transporting, switching of the active and inactive state and their regulation. A better understanding of the mechanism of M. oryzae fungicide resistance from this project will provide new insights for us to design new fungicide, and develop new strategies to better use of the existing fungicides.

稻瘟菌的抗药性限制了杀菌剂的使用效率，明确稻瘟菌抗药基因及其作用机理是合理利用已有杀菌剂及开发新杀菌剂的基础。大量研究表明稻瘟菌的抗药性现象普遍，常见的稻瘟菌抗药性是由其杀菌剂靶标基因突变导致的，本研究前期发现了稻瘟菌中由转运子介导的新的抗药性现象，通过群体遗传学、基因组学、分子生物学等方法鉴定到一个稻瘟菌抗杀菌剂相关ABC转运子基因MoABC-R1，敲除该基因后菌株对杀菌剂吡唑醚菌酯的抗药性完全丧失，同时对另一种杀菌剂嘧菌酯的抗药性也显著降低，表明MoABC-R1基因在抗药过程中起关键作用且可能参与多种农药的交互抗性。本项目拟进一步对MoABC-R1基因进行功能验证，同时，通过亚细胞定位、底物结合位点测试、参与运输杀菌剂的方向测试、活性与失活状态转化及调控等方面的研究来明确其参与稻瘟菌抗药性的分子机理。预期研究结果将为杀菌剂设计提供新靶标，为合理、高效利用现有杀菌剂提供理论支撑。

[背景]稻瘟菌的抗药性限制了杀菌剂的使用效率，明确稻瘟菌抗药基因及其作用机制是合理利用已有杀菌剂及开发新杀菌剂的基础。[研究内容]本研究前期发现了稻瘟菌中由转运子介导的对QoI类型杀菌剂的新的抗药性现象，但其功能和机制还不清楚，本研究紧密围绕这个科学问题，利用群体遗传学、全基因组关联分析、分子生物学试验等方法和技术，鉴定并明确了一个ABCC类型的稻瘟菌耐杀菌剂基因MoABC-R1的功能和初步作用机制。[主要研究结果]完成对120个稻瘟菌菌株深度重测序，完成基因组组装、注释、序列分析，以及完成两种杀菌剂吡唑醚菌酯和嘧菌酯的耐药性测试，通过关联分析发现，MoABC-R1基因外显子一个碱基A-T的颠换作用，导致MoABC-R1基因编码蛋白265位氨基酸由亮氨酸变为脯氨酸，从而使稻瘟菌对吡唑醚菌酯的敏感度呈现明显的两极分化（265Q更耐药）。MoABC-R1基因的敲除突变体moabc-R1 在吡唑醚菌酯培养条件下生长完全抑制，回补菌株moabc-R1::MoABC-R1 对吡唑醚菌酯的耐受性恢复到了野生型水平，互补试验证明了MoABC-R1在稻瘟菌耐吡唑醚菌酯过程中起关键作用。为了明确MoABC-R1基因作用机制。我们首先对其表达特征进行了分析，结果表明，MoABC-R1基因能被吡唑醚菌酯诱导表达。其次，我们对MoABC-R1基因是否参与稻瘟菌的致病过程进行了分析，结果表明，MoABC-R1基因缺失可导致稻瘟菌的致病力显著下降，即MoABC-R1基因在稻瘟菌致病过程中起关键作用。我们还明确了MoABC-R1基因在稻瘟菌致病过程中起关键作用的原因为其对稻瘟菌的附着胞形成起关键作用。另外，我们明确了在MoABC-R1基因缺失条件下，吡唑醚菌酯对稻瘟病的抑制效果最好（吡唑醚菌酯处理野生型菌株接种后生物量减少了30%，而吡唑醚菌酯处理MoABC-R1基因突变体菌株接种后生物量减少了80%）。吡唑醚菌酯对MoABC-R1基因突变体菌株的抑制幅度大大超过了MoABC-R1基因本身突变对稻瘟菌致病性的影响幅度，进一步明确了MoABC-R1基因在耐药、致病过程中的双重作用机制。[科学意义]MoABC-R1基因的鉴定初步阐明了稻瘟菌对QoI类型杀菌剂耐药性的新机制，为新型杀菌剂设计提供了潜在靶标。